Pesticidi igraju ključnu ulogu u rješavanju globalne nestašice hrane i borbi protiv vektorskih ljudskih bolesti. Međutim, rastući problem otpornosti na pesticide hitno zahtijeva otkriće novih spojeva koji ciljaju nedovoljno iskorištene ciljeve. Kanali potencijala prolaznih receptora insekata (TRPV) - Nanzhong (Nan) i inaktivni (Iav) - mogu formirati heterologne kanale (Nan-Iav) i lokalizirati se na mehanosenzorne organe koji posreduju geotropizam, sluh i propriocepciju kod insekata. Neki pesticidi, poput afidopirolidona (AP), ciljaju Nan-Iav putem nepoznatih mehanizama. AP je učinkovit protiv insekata koji probadaju i sišu (hemiptera), sprječavajući hranjenje ometanjem funkcije filamenata. AP se može vezati samo za Nan, ali samo Nan-Iav može stupiti u interakciju s agonistima, uključujući endogeni nikotinamid (NAM), pokazujući time aktivnost kanala. Unatoč potencijalu Nan-Iava kao cilja insekticida, malo se zna o njegovom sastavljanju kanala, regulatornim mjestima vezanja i regulaciji ovisnoj o Ca2+, što ometa daljnji razvoj insekticida. U ovoj studiji, krioelektronska mikroskopija je korištena za određivanje strukture Nan-Iav u kukcima Hemiptera u stanju bez kalmodulinskog liganda, kao i s AP i NAM na granici citoplazmatske domene ankirinskih ponavljanja (ARD). Iznenađujuće, otkrili smo da sam Nan protein može formirati pentamer, koji je stabiliziran AP-posredovanim ARD interakcijama. Ova studija otkriva molekularne interakcije između insekticida i agonista i Nan-Iav, ističući važnost ARD-a u funkciji i sastavljanju kanala te istražujući mehanizam regulacije Ca2+.
U kontekstu sve ozbiljnijih globalnih klimatskih promjena, pogoršanje globalne sigurnosti hrane jedan je od glavnih izazova 21. stoljeća, s kaskadnim posljedicama za društvo.1,2Izvješće Svjetske zdravstvene organizacije o stanju sigurnosti hrane i prehrane u svijetu za 2023. (SOFI) procjenjuje da otprilike 2,33 milijarde ljudi diljem svijeta pati od umjerene do teške nesigurnosti opskrbe hranom, što je dugotrajan problem.3,4Nažalost, procjenjuje se da se 20% do 30% ili više prinosa usjeva godišnje gubi zbog štetnika i patogena, a očekuje se da će globalno zatopljenje pogoršati otpornost na štetnike i ranjivost usjeva.4, 5, 6, 7, 8Razvoj pesticida ključan je ne samo za zaštitu usjeva od štetnika i smanjenje širenja vektorskih patogena, već i za borbu protiv vektorskih ljudskih bolesti poput denge, malarije i Chagasove bolesti, koje su sve otpornije na pesticide.5, 9, 10, 11
Među glavnim metama neurotoksičnih insekticida, heterotetramerni TRPV kanal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) predstavlja klasu meta insekticida otkrivenih tek u posljednjem desetljeću, uključujući komercijalno dostupne insekticide poput imidakloprida i piraklostrobina.12, 13, 14Polusintetički insekticid afidopirolifen (AP) je nedavno razvijen i komercijaliziran proizvod čija je glavna komponenta aktivni insekticid Inscalis®, koji veže AP na subnanomolarnoj razini aktivnosti.15AP pokazuje nisku akutnu toksičnost za oprašivače, korisne insekte i druge organizme kojima sredstvo nije namijenjeno, a kada se koristi prema uputama na etiketi, može smanjiti otpornost na druge insekticide.16, 17, 18Nan i Iav su široko rasprostranjeni među vrstama insekata, koeksprimiraju se samo u neuronima receptora istezanja akorda antena i udova te su ključni za sluh, percepciju gravitacije i propriocepciju.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid i piraklostrobin stimuliraju Nan-Iav kompleks jedinstvenim mehanizmom, u konačnici inhibirajući proprioceptivnu transdukciju signala.13, 16, 23Kod kukaca koji probadaju i sišu (hemiptera) poput lisnih uši i štitastih mušica, gubitak propriocepcije oštećuje njihovu sposobnost hranjenja, što na kraju dovodi do smrti.13,24Zanimljivo je da AP pokazuje visoki afinitet za Nan-Iav kompleks i nizak afinitet za sam Nan. Vezanje AP-a za Nan-Iav inducira električnu struju, ali vezanje za sam Nan ne stimulira aktivnost kanala. Sam Iav se uopće ne veže za AP.16To sugerira da se Nan i Iav mogu vezati i formirati različite Nan-Iav kanalske komplekse (npr. s različitim stehiometrijskim omjerima ili različitim rasporedima unutar istog stehiometrijskog omjera) ili da se AP može vezati na više mjesta. Nadalje, prirodni agonist nikotinamid (NAM) veže se na Drosophila Nan-Iav s mikromolarnim afinitetom, pokazujući učinke slične onima kod lisnih uši (AP) in vitro.16,25i sprječavanje razmnožavanja i hranjenja lisnih uši, što u konačnici dovodi do njihove smrti25,26Ovi podaci postavljaju mnoga pitanja. Na primjer, ostaje nejasno kako se formira Nan-Iav heterodimer, koja se mjesta vezanja koriste za modulaciju malih molekula i kako te male molekule reguliraju funkciju kanala potiskivanjem propriocepcije. Nadalje, razlozi zašto je sam Nan neaktivan i ima nizak afinitet za AP, dok je Nan-Iav heterodimer aktivan i veže AP s većim afinitetom, ostaju nejasni. Konačno, malo se zna o Ca2+-ovisnoj regulaciji Nan-Iav funkcije i kako je ona integrirana u procese neuronske signalizacije.13,21
U ovoj studiji, kombinirajući krioelektronsku mikroskopiju, elektrofiziologiju i tehnike vezanja radioliganda, razjasnili smo sastavljanje Nan-Iav i mehanizam njegovog vezanja na regulatore malih molekula. Nadalje, otkrili smo konstitutivno vezani kalmodulin (CaM) na Iav i AP-stabilizirane Nan pentamere. Ovi rezultati pružaju važne uvide u regulaciju kalcijevih iona u kanalima, sastavljanje kanala i čimbenike koji određuju afinitet vezanja liganda. Što je još važnije, potvrdili smo da ARD igra središnju ulogu u tim procesima. Naša studija kompletnih kanala insekata vezanih za relevantne poljoprivredne pesticide27, 28, 29otvara perspektive za razvoj industrije pesticida, poboljšavajući učinkovitost i specifičnost pesticida te omogućujući primjenu spojeva usmjerenih na TRPV na druge vrste kako bi se riješila globalna sigurnost hrane i širenje vektorskih bolesti.
Također smo otkrili da je Nan-Iav reguliran Ca2+, a mehanizam regulacije posredovan je konstitutivno vezanim CaM. Važno je da se ova Ca2+-ovisna regulacija Nav pomoću CaM značajno razlikuje od mehanizama regulacije drugih ionskih kanala (npr. naponski reguliranih Na+ kanala i TRPV5/6 kanala).52, 53, 54, 55, 56, 57U Nav1.2 kanalu, C-terminalna domena CaM-a spiralno se povezuje s C-terminalnom domenom (CTD), a Ca2+ inducira vezanje svoje N-terminalne domene na distalni dio CTD-a.56U TRPV5/6 kanalu, C-terminalna domena CaM veže se na CTH, a Ca2+ inducira širenje svoje N-terminalne domene prema gore u poru, čime blokira propusnost kationa.53,54Predlažemo model za Ca2+-reguliranu funkciju Nan-Iav-CaM (slika 4h). U ovom modelu, N-terminalna domena CaM konstitutivno se veže na C-terminalnu domenu (CTH) Iav. U stanju mirovanja (niska koncentracija [Ca2+]), C-terminalna domena CaM interagira s Nan-om, stabilizirajući ARD konformaciju i time potičući otvaranje kanala. Vezanje agonista/insekticida na kanal inducira otvaranje pora, što dovodi do priljeva Ca2+. Ca2+ se zatim veže na CaM, uzrokujući disocijaciju C-terminalne domene od ARD-a Nan-a. Budući da blokiranje vezanja CaM u biti ukida inhibitorni učinak Ca2+, ova disocijacija modulira ARD pokretljivost, uzrokujući time Ca2+-ovisnu inhibiciju ili desenzibilizaciju. Brzi oporavak struja kanala nakon elucije kalcijevih iona (slika 4g) sugerira da ovaj mehanizam olakšava brze odgovore na Ca2+-posredovane neuronske signale. Nadalje, C-terminalna regija proteina Iav, koja je još uvijek slabo istražena, navodno igra i druge uloge u ciljanju kanala i regulaciji struje.21
Konačno, naša studija predstavlja strukturu visoke rezolucije insekticid-insekticidnog TRP kanalskog kompleksa od poljoprivredne važnosti - otkriće koje nam je prethodno bilo nepoznato. Značajno je da smo okarakterizirali strukturu i funkciju insekticidnog kanala u ljudskim stanicama (HEK293S GnTi–) umjesto u stanicama insekata. Suočeni s rastućom otpornosti na insekticide i kontinuiranim pritiskom na sigurnost hrane i patogene, naš rad pruža važne informacije koje će olakšati razvoj novih insekticida u korist ljudskog zdravlja i globalne sigurnosti hrane. Studije su pokazale da su insekticidi poput AP učinkoviti protiv nekih štetnika kada se koriste prema uputama na etiketi i imaju nisku akutnu toksičnost za korisne oprašivače, što pokazuje njihovu sigurnost za okoliš.13,16Nadalje, testiranje nekih derivata AP-a na komarcima pokazalo je da oni s vremenom gube sposobnost letenja. Razumijevanje načina na koji se ovi modulirajući spojevi vežu na Nan-Iav olakšat će modifikaciju postojećih spojeva ili razvoj novih spojeva za učinkovitije iprecizansuzbijanje štetočina. Naša studija pokazuje da je Nan-Iav ARD sučelje ključno ne samo za regulaciju aktivnosti endogenih spojeva, pesticida i Ca2+-CaM, već i za sastavljanje kanala. Predlažemo da bi prekidanje sastavljanja heterodimera malim molekulama mogao biti jedinstven i obećavajući pristup razvoju inhibitora ionskih kanala.
Od osam ortolognih gena, odabrani su geni pune duljine smeđeg kornjaša (Halyomorpha halys) Nanchung i Inactive, koji pokazuju izvrsnu stabilnost u deterdžentima. Sintetizirani geni su kodonski optimizirani za ljudsku ekspresiju i klonirani u pBacMam pCMV-DEST vektor (Life Technologies) korištenjem restrikcijskih mjesta XhoI i EcoRI. To je osiguralo da su klonovi u okviru s C-terminalnim GFP-FLAG-10xHis i mCherry-FLAG-10xHis oznakama, koje cijepa HRC-3C proteaza (PPX), omogućujući neovisno...izrazPrajmeri korišteni za kloniranje Nanchunga i Inactivea u pBacMam vektor bili su sljedeći:
Mikroskopske slike pojedinačnih čestica dobivene su na Titan Krios G2 transmisijskom elektronskom mikroskopu (FEI) opremljenom K3 kamerom i Gatan BioQuantum energetskim filterom. Mikroskop je radio na 300 keV, s postavkom energije od 20 eV, veličinom piksela uzorka od 1,08 Å/piksel (nominalno povećanje od 81 000x) i gradijentom defokusiranja u rasponu od -0,8 do -2,2 μm. Snimanje videa provedeno je pri 40 sličica u sekundi pomoću Latitude S mikroskopa (Gatan) s nominalnom brzinom doze od 25 e–px−1 s−1, vremenom ekspozicije od 2,4 s i ukupnom dozom od približno 60 e–Å−2.
Korekcija gibanja induciranog snopom i ponderiranje doze provedeni su na filmu pomoću MotionCor2 u RELION-u 4.061. Procjena parametra funkcije prijenosa kontrasta (CTF) provedena je u cryoSPARC-u korištenjem metode procjene CTF-a temeljene na zakrpama62. Fotomikrografije s rezolucijom CTF prilagodbe ≥4 Å isključene su iz naknadne analize. Tipično, podskup od 500–1000 fotomikrografija korišten je za odabir točaka u cryoSPARC-u, nakon čega je slijedilo nekoliko krugova 2D klasifikacije nakon filtriranja kako bi se dobila jasna referentna slika za odabir čestica na temelju predloška. Čestice su zatim ekstrahirane korištenjem 64-pikselnih graničnih okvira i 4-strukog binninga. Izvršeno je nekoliko krugova 2D klasifikacije kako bi se uklonile neželjene kategorije čestica. Početni 3D model rekonstruiran je korištenjem ab initio rekonstrukcije i profinjen korištenjem neuniformnog profinjenosti u cryoSPARC-u. 3D klasifikacija provedena je u cryoSPARC-u ili RELION-u na temelju heterogenosti ARD-a. Nije uočena značajna heterogenost membranskih domena. Čestice su profinjene korištenjem metoda C1 i C2; Čestice s većom C2 rezolucijom smatrane su simetričnima u odnosu na C2 i uvezene su u RELION za Bayesovo pročišćavanje. Čestice su zatim prenesene natrag u cryoSPARC za konačno neuniformno i lokalno pročišćavanje. Konačna rezolucija i broj čestica prikazani su u Tablici 1.
Prilikom obrade Nan+AP pentamera istražili smo različite metode za poboljšanje rezolucije membranskih domena (posebno područja pora), kao što su oduzimanje signala i maskiranje TMD-a. Međutim, ovi pokušaji nisu bili uspješni zbog potencijalno ekstremnog poremećaja u području pora i ukupne heterogenosti TMD-a. Konačna rezolucija izračunata je pomoću maske automatski generirane metodom neuniformne obrade u cryoSPARC-u, prvenstveno ciljajući ARD područje. Time je postignuta znatno veća rezolucija od membranskih domena (posebno VSLD područja).
Početni de novo modeli apo oblika Nanchung i Inactive kukaca prvo su generirani pomoću Coot63, a modeli Nan i Iav kukaca generirani su pomoću AlphaFold264 za identifikaciju područja niske pouzdanosti. Modeliranje kalmodulina temeljilo se na prilagodbama krutog tijela modela vezanja Ca2+ i bez Ca2+ u PDB pristupima 4JPZ56 i 1CFD65. Modeli su profinjeni korištenjem sfernog profinjenja kako bi se osigurala ispravna stereokemija i dobra geometrija. Fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin i fosfatidilserin zatim su modelirani kao dobro definirane gustoće lipida, a NAM i AP ligandi su smješteni u odgovarajuće gustoće u čvrstim spojevima. Datoteke ograničenja generirane su iz SMILES niza izoformi korištenjem eLBOW u PHENIX66. Konačno, modeli su profinjeni u stvarnom prostoru u PHENIX-u korištenjem lokalnog pretraživanja mreže i globalne minimizacije s ograničenjima sekundarne strukture. MolProbity poslužitelj korišten je za pročišćavanje modela i strukturnu analizu, a ilustracije su provedene pomoću PyMOL-a i UCSF Chimera X. 67,68,69 Analiza otvora blende provedena je pomoću HOLE poslužitelja,70 a mapiranje očuvanja sekvenci provedeno je pomoću Consurf poslužitelja.71
Statistička analiza provedena je korištenjem programa Igor Pro 6.2, Excel Office 365 i GraphPad Prism 7.0. Svi kvantitativni podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna pogreška (SEM). Za usporedbu dvije skupine korišten je Studentov t-test (dvostrani, nespareni). Za usporedbu više skupina korištena je jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) nakon koje je slijedio Dunnettov post hoc test. *P< 0,05, **P< 0,01 i ***PVrijednosti < 0,001 smatrane su statistički značajnima ovisno o distribuciji podataka. Vrijednosti Kd i Ki te njihovi asimetrični 95% intervali pouzdanosti izračunati su pomoću programa GraphPad Prism 10.
Za više detalja o metodologiji istraživanja, pogledajte sažetak izvješća o prirodnom portfelju na koji se odnosi poveznica u ovom članku.
Početni model izgrađen je korištenjem kalmodulinskih modela iz baza podataka PDB 4JPZ i 1CFD. Koordinate su pohranjene u Banci podataka o proteinima (PDB) pod pristupnim brojevima 9NVN (Nan-Iav-CaM bez liganda), 9NVO (Nan-Iav-CaM vezan na nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM vezan na nikotinamid i EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM vezan na afenidolpirolin i kalcij), 9NVR (Nan-Iav-CaM vezan na afenidolpirolin i EDTA) i 9NVS (Nan pentamer vezan na afenidolpirolin). Odgovarajuće slike krioelektronske mikroskopije pohranjene su u Bazi podataka elektronske mikroskopije (EMDB) pod sljedećim pristupnim brojevima: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez liganda), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM kompleks s nikotinamidom), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM kompleks s nikotinamidom i EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM kompleks s afidopirolinom i kalcijem), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM kompleks s afidopirolinom i EDTA) i EMD-49849 (Nan pentamer kompleks s afidopirolinom). Sirovi podaci za funkcionalnu analizu prikazani su u ovom radu.
Vrijeme objave: 28. siječnja 2026.