Antihelmintik N,N-dietil-m-toluamid (DEET) navodno inhibira AChE (acetilkolinesterazu) i ima potencijalna kancerogena svojstva zbog pretjerane vaskularizacije. U ovom radu pokazujemo da DEET specifično stimulira endotelne stanice koje potiču angiogenezu, čime se povećava rast tumora. DEET aktivira stanične procese koji dovode do angiogeneze, uključujući proliferaciju, migraciju i adheziju. To je povezano s povećanom proizvodnjom NO i ekspresijom VEGF u endotelnim stanicama. Utišavanje M3 ili korištenje farmakoloških inhibitora M3 ukinulo je sve te učinke, što sugerira da je angiogeneza inducirana DEET-om osjetljiva na M3. Eksperimenti koji uključuju signaliziranje kalcija u endotelnim i HEK stanicama koje prekomjerno izražavaju M3 receptore, kao i studije vezivanja i spajanja, pokazuju da DEET djeluje kao alosterički modulator M3 receptora. Nadalje, DEET inhibira AChE, povećavajući tako bioraspoloživost acetilkolina i njegovo vezanje na M3 receptore, te pojačavajući proangiogene učinke kroz alosteričku regulaciju.
Primarni EC izolirani su iz aorte Swiss miševa. Metoda ekstrakcije je prilagođena iz Kobayashijevog protokola 26 . Mišji EC su uzgajani u EBM-2 mediju dopunjenom s 5% toplinski inaktiviranog FBS-a do četvrtog prolaza.
Učinak dviju koncentracija DEET-a na proliferaciju HUVEC, U87MG ili BF16F10 analiziran je pomoću CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Ukratko, 5,103 stanica po jažici posađeno je u ploču s 96 jažica, ostavljeno da se pričvrsti preko noći, a zatim tretirano DEET-om 24 sata. Nakon uklanjanja medija za rast, dodajte otopinu za vezanje boje u svaku jažicu mikropločice i inkubirajte stanice na 37 °C 30 minuta. Razine fluorescencije određene su korištenjem multimodnog čitača mikropločica Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Njemačka) opremljenog 485 nm ekscitacijskim filtrima i 530 nm emisijskim filtrima.
HUVEC su zasađene u ploče s 96 jažica u gustoći od 104 stanice po jažici. Stanice su tretirane DEET-om 24 sata. Viabilnost stanica procijenjena je pomoću kolorimetrijskog MTT testa (Sigma-Aldrich, M5655). Vrijednosti optičke gustoće dobivene su na multimodnom čitaču mikropločica (Mithras LB940) na valnoj duljini od 570 nm.
Učinci DEET-a proučavani su pomoću in vitro testova angiogeneze. Tretman s 10-8 M ili 10-5 M DEET povećao je stvaranje duljine kapilara u HUVEC-ovima (Slika 1a, b, bijele trake). U usporedbi s kontrolnom skupinom, liječenje koncentracijama DEET-a u rasponu od 10-14 do 10-5 M pokazalo je da je duljina kapilara dosegla plato na 10-8 M DEET (dodatna slika S2). Nije pronađena značajna razlika u in vitro proangiogenom učinku HUVEC-a tretiranih DEET-om u rasponu koncentracija od 10-8 M i 10-5 M.
Kako bismo odredili učinak DEET-a na neovaskularizaciju, proveli smo in vivo studije neovaskularizacije. Nakon 14 dana, miševi kojima su ubrizgane endotelne stanice prethodno uzgojene s 10-8 M ili 10-5 M DEET pokazali su značajno povećanje sadržaja hemoglobina (Slika 1c, bijele trake).
Nadalje, neovaskularizacija izazvana DEET-om proučavana je na miševima s ksenograftom U87MG kojima je svakodnevno (ip) ubrizgavan DEET u dozi za koju se zna da inducira koncentracije u plazmi od 10-5 M, što je normalno kod izloženih ljudi. u 23. Detektabilni tumori (tj. tumori >100 mm3) uočeni su 14 dana nakon injekcije U87MG stanica u miševe. 28. dana, rast tumora bio je značajno pojačan kod miševa tretiranih DEET-om u usporedbi s kontrolnim miševima (slika 1d, kvadratići). Nadalje, bojenje tumora CD31 pokazalo je da DEET značajno povećava površinu kapilara, ali ne i gustoću mikrožila. (Sl. 1e–g).
Za određivanje uloge muskarinskih receptora u DETA-induciranoj proliferaciji korišteno je 10-8 M ili 10-5 M DETA u prisutnosti pFHHSiD (10-7 M, selektivni antagonist M3 receptora). Liječenje HUVEC-a. pFHHSiD je potpuno blokirao proliferativna svojstva DETA u svim koncentracijama (Tablica 1).
U tim smo uvjetima također ispitali hoće li DEET povećati duljinu kapilara u HUVEC stanicama. Slično, pFHHSiD je značajno spriječio duljinu kapilara izazvanu DEET-om (Slika 1a, b, sive trake). Nadalje, slični pokusi izvedeni su s M3 siRNA. Iako kontrolna siRNA nije bila učinkovita u poticanju stvaranja kapilara, utišavanje muskarinskog receptora M3 ukinulo je sposobnost DEET-a da poveća duljinu kapilara (Slika 1a, b, crne trake).
Nadalje, i 10-8 M ili 10-5 M DEET-inducirana vaskularizacija in vitro i neovaskularizacija in vivo potpuno su blokirane pFHHSiD (Slika 1c, d, kružići). Ovi rezultati pokazuju da DEET potiče angiogenezu kroz put osjetljiv na selektivne antagoniste M3 receptora ili M3 siRNA.
AChE je molekularna meta DEET-a. Lijekovi kao što je donepezil, koji djeluju kao inhibitori AChE, mogu stimulirati EC angiogenezu in vitro i u modelima ishemije stražnjih ekstremiteta miša14. Ispitali smo učinak dviju koncentracija DEET-a na aktivnost enzima AChE u HUVEC-u. Niske (10-8 M) i visoke (10-5 M) koncentracije DEET-a smanjile su endotelnu AChE aktivnost u usporedbi s kontrolnim uvjetima (slika 2).
Obje koncentracije DEET-a (10-8 M i 10-5 M) smanjile su aktivnost acetilkolinesteraze na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) korišten je kao kontrola za inhibitore acetilkolinesteraze. Rezultati su izraženi kao postotak AChE aktivnosti na HUVEC tretiranim s dvije koncentracije DEET u usporedbi sa stanicama tretiranim nosačem. Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM šest neovisnih eksperimenata. *p < 0,05 u usporedbi s kontrolom (Kruskal-Wallisov i Dunnov test višestruke usporedbe).
Dušikov oksid (NO) uključen je u angiogenetski proces 33, stoga je proučavana proizvodnja NO u HUVEC-ovima stimuliranim DEET-om. DEET-om tretirana endotelna proizvodnja NO bila je povećana u usporedbi s kontrolnim stanicama, ali je dosegla značaj samo pri dozi od 10-8 M (slika 3c). Kako bi se odredile molekularne promjene koje kontroliraju proizvodnju NO izazvanu DEET-om, ekspresija i aktivacija eNOS-a analizirani su Western blotom. Iako liječenje DEET-om nije promijenilo ekspresiju eNOS-a, značajno je povećalo fosforilaciju eNOS-a na njegovom aktivacijskom mjestu (Ser-1177), dok je smanjilo njegovo inhibicijsko mjesto (Thr-495) u usporedbi s netretiranim stanicama u fosforilaciji eNOS-a (Slika 3d). Nadalje, omjer fosforiliranog eNOS-a na aktivacijskom i inhibicijskom mjestu izračunat je nakon normalizacije količine fosforiliranog eNOS-a prema ukupnoj količini enzima. Ovaj omjer bio je značajno povećan u HUVEC-ovima tretiranim sa svakom koncentracijom DEET-a u usporedbi s netretiranim stanicama (Slika 3d).
Na kraju, ekspresija VEGF-a, jednog od glavnih proangiogenih čimbenika, analizirana je Western blotom. DEET je značajno povećao ekspresiju VEGF, dok je pFHHSiD potpuno blokirao tu ekspresiju.
Budući da su učinci DEET-a osjetljivi i na farmakološku blokadu i na nižu regulaciju M3 receptora, testirali smo hipotezu da bi DEET mogao poboljšati signaliziranje kalcija. Iznenađujuće, DEET nije uspio povećati citoplazmatski kalcij u HUVEC (podaci nisu prikazani) i HEK/M3 (Sl. 4a, b) za obje korištene koncentracije.
Vrijeme objave: 30. prosinca 2024