Antihelmintski lijek N,N-dietil-m-toluamid (DEET) je zabilježeno da inhibira AChE (acetilkolinesterazu) i ima potencijalno kancerogena svojstva zbog prekomjerne vaskularizacije. U ovom radu pokazujemo da DEET specifično stimulira endotelne stanice koje potiču angiogenezu, čime se povećava rast tumora. DEET aktivira stanične procese koji dovode do angiogeneze, uključujući proliferaciju, migraciju i adheziju. To je povezano s povećanom proizvodnjom NO i ekspresijom VEGF-a u endotelnim stanicama. Utišavanje M3 ili korištenje farmakoloških inhibitora M3 ukinulo je sve ove učinke, što sugerira da je angiogeneza inducirana DEET-om osjetljiva na M3. Eksperimenti koji uključuju kalcijevu signalizaciju u endotelnim i HEK stanicama koje prekomjerno eksprimiraju M3 receptore, kao i studije vezanja i spajanja, pokazuju da DEET djeluje kao alosterički modulator M3 receptora. Nadalje, DEET inhibira AChE, čime se povećava bioraspoloživost acetilkolina i njegovo vezanje na M3 receptore te pojačavaju proangiogene učinke putem alosteričke regulacije.
Primarne EC-ove izolirane su iz aorte švicarskih miševa. Metoda ekstrakcije prilagođena je Kobayashijevom protokolu 26. Mišje EC-ove uzgajane su u EBM-2 mediju nadopunjenom s 5% toplinski inaktiviranog FBS-a do četvrtog pasaže.
Učinak dviju koncentracija DEET-a na proliferaciju HUVEC-a, U87MG ili BF16F10 analiziran je pomoću CyQUANT kompleta za ispitivanje proliferacije stanica (Molecular Probes, C7026). Ukratko, 5.103 stanica po jažici posijano je u ploču s 96 jažica, ostavljeno da se pričvrsti preko noći, a zatim tretirano s DEET-om tijekom 24 sata. Nakon uklanjanja medija za rast, u svaku jažicu mikroploče dodajte otopinu za vezanje boje i inkubirajte stanice na 37 °C tijekom 30 minuta. Razine fluorescencije određene su pomoću Mithras LB940 multimodnog čitača mikroploča (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Njemačka) opremljenog filterima za pobudu od 485 nm i filterima za emisiju od 530 nm.
HUVEC su zasijane u ploče s 96 jažica u gustoći od 10⁴ stanica po jažici. Stanice su tretirane DEET-om tijekom 24 sata. Stanična vijabilnost procijenjena je kolorimetrijskim MTT testom (Sigma-Aldrich, M5655). Vrijednosti optičke gustoće dobivene su na multimodnom čitaču mikroploča (Mithras LB940) na valnoj duljini od 570 nm.
Učinci DEET-a proučavani su in vitro testovima angiogeneze. Tretman s 10-8 M ili 10-5 M DEET-a povećao je stvaranje kapilarne duljine u HUVEC-ima (slika 1a, b, bijele trake). U usporedbi s kontrolnom skupinom, tretman koncentracijama DEET-a u rasponu od 10-14 do 10-5 M pokazao je da je kapilarna duljina dosegla plato pri 10-8 M DEET-a (dodatna slika S2). Nije pronađena značajna razlika u in vitro proangiogenom učinku HUVEC-a tretiranih DEET-om u rasponu koncentracija od 10-8 M i 10-5 M.
Kako bismo utvrdili učinak DEET-a na neovaskularizaciju, proveli smo in vivo studije neovaskularizacije. Nakon 14 dana, miševi kojima su injicirane endotelne stanice prethodno kultivirane s 10-8 M ili 10-5 M DEET-a pokazali su značajno povećanje sadržaja hemoglobina (slika 1c, bijele trake).
Nadalje, proučavana je DEET-om inducirana neovaskularizacija kod miševa s ksenograftom U87MG kojima je svakodnevno (ip) injiciran DEET u dozi za koju se zna da inducira koncentracije u plazmi od 10-5 M, što je normalno kod izloženih ljudi. u 23. Detektabilni tumori (tj. tumori >100 mm3) uočeni su 14 dana nakon injekcije stanica U87MG u miševe. Na 28. dan, rast tumora bio je značajno pojačan kod miševa tretiranih DEET-om u usporedbi s kontrolnim miševima (slika 1d, kvadrati). Nadalje, bojenje tumora s CD31 pokazalo je da DEET značajno povećava površinu kapilara, ali ne i gustoću mikrožila. (slika 1e-g).
Za određivanje uloge muskarinskih receptora u proliferaciji induciranoj DETA-om korišteno je 10-8 M ili 10-5 M DETA u prisutnosti pFHHSiD (10-7 M, selektivni antagonist M3 receptora). Tretman HUVEC-a s pFHHSiD potpuno je blokirao proliferativna svojstva DETA-e pri svim koncentracijama (Tablica 1).
U tim uvjetima, također smo ispitali hoće li DEET povećati duljinu kapilara u HUVEC stanicama. Slično tome, pFHHSiD je značajno spriječio duljinu kapilara induciranu DEET-om (slika 1a, b, sive trake). Nadalje, slični eksperimenti provedeni su s M3 siRNA. Iako kontrolna siRNA nije bila učinkovita u poticanju stvaranja kapilara, utišavanje M3 muskarinskog receptora ukinulo je sposobnost DEET-a da poveća duljinu kapilara (slika 1a, b, crne trake).
Nadalje, i 10-8 M ili 10-5 M DEET-inducirana vaskularizacija in vitro i neovaskularizacija in vivo bile su potpuno blokirane pFHHSiD-om (slika 1c, d, krugovi). Ovi rezultati ukazuju na to da DEET potiče angiogenezu putem puta osjetljivog na selektivne antagoniste M3 receptora ili M3 siRNA.
AChE je molekularna meta DEET-a. Lijekovi poput donepezila, koji djeluju kao inhibitori AChE, mogu stimulirati angiogenezu endotelnih stanica in vitro i u modelima ishemije stražnjih udova miševa14. Testirali smo učinak dviju koncentracija DEET-a na aktivnost enzima AChE u HUVEC-ima. Niske (10-8 M) i visoke (10-5 M) koncentracije DEET-a smanjile su aktivnost endotelnog AChE u usporedbi s kontrolnim uvjetima (slika 2).
Obje koncentracije DEET-a (10-8 M i 10-5 M) smanjile su aktivnost acetilkolinesteraze na HUVEC-ima. BW284c51 (10-5 M) korišten je kao kontrola za inhibitore acetilkolinesteraze. Rezultati su izraženi kao postotak aktivnosti AChE na HUVEC-ima tretiranim s dvije koncentracije DEET-a u usporedbi sa stanicama tretiranim nosačem. Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM šest neovisnih eksperimenata. *p < 0,05 u usporedbi s kontrolom (Kruskal-Wallisov i Dunnov test višestruke usporedbe).
Dušikov oksid (NO) uključen je u angiogene procese 33, stoga je proučavana produkcija NO u HUVEC-ima stimuliranim DEET-om. Endotelna produkcija NO tretirana DEET-om povećana je u usporedbi s kontrolnim stanicama, ali je dosegla značajnost tek pri dozi od 10-8 M (slika 3c). Kako bi se odredile molekularne promjene koje kontroliraju produkciju NO induciranu DEET-om, ekspresija i aktivacija eNOS-a analizirane su Western blottingom. Iako tretman DEET-om nije promijenio ekspresiju eNOS-a, značajno je povećao fosforilaciju eNOS-a na njegovom aktivacijskom mjestu (Ser-1177), a smanjio njegovo inhibitorno mjesto (Thr-495) u usporedbi s netretiranim stanicama u fosforilaciji eNOS-a (slika 3d). Nadalje, omjer fosforiliranog eNOS-a na aktivacijskom i inhibitornom mjestu izračunat je nakon normalizacije količine fosforiliranog eNOS-a prema ukupnoj količini enzima. Ovaj omjer je značajno povećan u HUVEC-ima tretiranim svakom koncentracijom DEET-a u usporedbi s netretiranim stanicama (slika 3d).
Konačno, ekspresija VEGF-a, jednog od glavnih proangiogenih faktora, analizirana je Western blot analizom. DEET je značajno povećao ekspresiju VEGF-a, dok je pFHHSiD potpuno blokirao tu ekspresiju.
Budući da su učinci DEET-a osjetljivi i na farmakološku blokadu i na smanjenje M3 receptora, testirali smo hipotezu da bi DEET mogao pojačati kalcijevu signalizaciju. Iznenađujuće, DEET nije uspio povećati citoplazmatski kalcij u HUVEC (podaci nisu prikazani) i HEK/M3 (slika 4a, b) za obje korištene koncentracije.
Vrijeme objave: 30. prosinca 2024.