U ovoj studiji, stimulativni učinci kombiniranog liječenjaregulatori rasta biljakaIstražen je utjecaj nanočestica željezovog oksida (2,4-D i kinetina) i željezovog oksida (Fe₃O₄-NP) na in vitro morfogenezu i proizvodnju sekundarnih metabolita u *Hypericum perforatum* L. Optimizirani tretman [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] značajno je poboljšao parametre rasta biljaka: visina biljke povećala se za 59,6%, duljina korijena za 114,0%, broj pupova za 180,0% i svježa težina kalusa za 198,3% u usporedbi s kontrolnom skupinom. Ovaj kombinirani tretman također je poboljšao učinkovitost regeneracije (50,85%) i povećao sadržaj hipericina za 66,6%. GC-MS analiza otkrila je visok sadržaj hiperozida, β-patolena i cetilnog alkohola, što čini 93,36% ukupne površine vrha, dok se sadržaj ukupnih fenola i flavonoida povećao za čak 80,1%. Ovi rezultati ukazuju na to da regulatori rasta biljaka (PGR) i Fe₃O₄ nanočestice (Fe₃O₄-NP) imaju sinergijski učinak stimulirajući organogenezu i akumulaciju bioaktivnih spojeva, što predstavlja obećavajuću strategiju za biotehnološko poboljšanje ljekovitog bilja.
Gospina trava (Hypericum perforatum L.), također poznata kao gospina trava, višegodišnja je zeljasta biljka iz porodice Hypericaceae koja ima ekonomsku vrijednost.[1] Njezine potencijalne bioaktivne komponente uključuju prirodne tanine, ksantone, floroglucinol, naftalendiantron (hiperin i pseudohiperin), flavonoide, fenolne kiseline i eterična ulja.[2,3,4] Gospina trava može se razmnožavati tradicionalnim metodama; međutim, sezonalnost tradicionalnih metoda, niska klijavost sjemena i osjetljivost na bolesti ograničavaju njezin potencijal za uzgoj velikih razmjera i kontinuirano stvaranje sekundarnih metabolita.[1,5,6]
Stoga se in vitro kultura tkiva smatra učinkovitom metodom za brzo razmnožavanje biljaka, očuvanje resursa germplazme i povećani prinos ljekovitih spojeva [7, 8]. Regulatori rasta biljaka (PGR) igraju ključnu ulogu u regulaciji morfogeneze i neophodni su za in vitro uzgoj kalusa i cijelih organizama. Optimizacija njihovih koncentracija i kombinacija ključna je za uspješan završetak ovih razvojnih procesa [9]. Stoga je razumijevanje odgovarajućeg sastava i koncentracije regulatora važno za poboljšanje rasta i regenerativne sposobnosti gospine trave (H. perforatum) [10].
Nanočestice željeznog oksida (Fe₃O₄) su klasa nanočestica koje su razvijene ili se razvijaju za kulturu tkiva. Fe₃O₄ ima značajna magnetska svojstva, dobru biokompatibilnost i sposobnost poticanja rasta biljaka i smanjenja stresa iz okoliša, pa je privukao znatnu pozornost u dizajnu kultura tkiva. Potencijalne primjene ovih nanočestica mogu uključivati optimizaciju kulture in vitro za poticanje diobe stanica, poboljšanje unosa hranjivih tvari i aktiviranje antioksidativnih enzima [11].
Iako su nanočestice pokazale dobre učinke poticanja rasta biljaka, studije o kombiniranoj primjeni Fe₃O₄ nanočestica i optimiziranih regulatora rasta biljaka u *H. perforatum* ostaju rijetke. Kako bi se popunila ta praznina u znanju, ova studija procijenila je učinke njihovih kombiniranih učinaka na in vitro morfogenezu i proizvodnju sekundarnih metabolita kako bi se pružili novi uvidi za poboljšanje karakteristika ljekovitih biljaka. Stoga ova studija ima dva cilja: (1) optimizirati koncentraciju regulatora rasta biljaka kako bi se učinkovito potaknulo stvaranje kalusa, regeneracija izdanaka i ukorjenjivanje in vitro; i (2) procijeniti učinke Fe₃O₄ nanočestica na parametre rasta in vitro. Budući planovi uključuju procjenu stope preživljavanja regeneriranih biljaka tijekom aklimatizacije (in vitro). Očekuje se da će rezultati ove studije značajno poboljšati učinkovitost mikropropagacije *H. perforatum*, čime će doprinijeti održivoj upotrebi i biotehnološkoj primjeni ove važne ljekovite biljke.
U ovom istraživanju dobili smo eksplantate listova jednogodišnjih biljaka gospine trave uzgojenih na polju (matične biljke). Ovi eksplantati korišteni su za optimizaciju uvjeta uzgoja in vitro. Prije uzgoja, listovi su temeljito isprani pod mlazom destilirane vode nekoliko minuta. Površine eksplantata zatim su dezinficirane uranjanjem u 70%-tni etanol tijekom 30 sekundi, a zatim uranjanjem u 1,5%-tnu otopinu natrijevog hipoklorita (NaOCl) koja sadrži nekoliko kapi Tween 20 tijekom 10 minuta. Na kraju, eksplantati su tri puta isprani sterilnom destiliranom vodom prije prijenosa u sljedeći medij za uzgoj.
Tijekom sljedeća četiri tjedna mjereni su parametri regeneracije izdanaka, uključujući brzinu regeneracije, broj izdanaka po eksplantatu i duljinu izdanka. Kada su regenerirani izdanci dosegli duljinu od najmanje 2 cm, preneseni su u medij za ukorjenjivanje koji se sastojao od MS medija upola jače koncentracije, 0,5 mg/L indolmaslačne kiseline (IBA) i 0,3% guar gume. Kultura ukorjenjivanja nastavljena je tri tjedna, tijekom kojih su mjereni brzina ukorjenjivanja, broj korijena i duljina korijena. Svaki tretman ponovljen je tri puta, s 10 eksplantata uzgojenih po ponavljanju, što je dalo približno 30 eksplantata po tretmanu.
Visina biljke mjerena je u centimetrima (cm) pomoću ravnala, od baze biljke do vrha najvišeg lista. Duljina korijena mjerena je u milimetrima (mm) odmah nakon pažljivog uklanjanja sadnica i uklanjanja supstrata za uzgoj. Broj pupova po eksplantu prebrojan je izravno na svakoj biljci. Broj crnih mrlja na listovima, poznatih kao kvržice, mjeren je vizualno. Vjeruje se da su te crne kvržice žlijezde koje sadrže hipericin ili oksidativne mrlje, a koriste se kao fiziološki pokazatelj odgovora biljke na tretman. Nakon uklanjanja cijelog supstrata za uzgoj, svježa težina sadnica mjerena je elektroničkom vagom s točnošću od miligrama (mg).
Metoda za izračunavanje brzine stvaranja kalusa je sljedeća: nakon uzgoja eksplantata u mediju koji sadrži različite regulatore rasta (kinaze, 2,4-D i Fe3O4) tijekom četiri tjedna, broji se broj eksplantata sposobnih za stvaranje kalusa. Formula za izračunavanje brzine stvaranja kalusa je sljedeća:
Svaki tretman je ponovljen tri puta, s najmanje 10 eksplantata pregledanih u svakom ponavljanju.
Stopa regeneracije odražava udio kalusnog tkiva koje uspješno završi proces diferencijacije pupka nakon faze formiranja kalusa. Ovaj pokazatelj pokazuje sposobnost kalusnog tkiva da se transformira u diferencirano tkivo i izraste u nove biljne organe.
Koeficijent ukorjenjivanja je omjer broja grana sposobnih za ukorjenjivanje i ukupnog broja grana. Ovaj pokazatelj odražava uspjeh faze ukorjenjivanja, što je ključno u mikropropagaciji i razmnožavanju biljaka, jer dobro ukorjenjivanje pomaže sadnicama da bolje prežive u uvjetima uzgoja.
Hipericinski spojevi ekstrahirani su s 90%-tnim metanolom. Pedeset mg osušenog biljnog materijala dodano je u 1 ml metanola i sonicirano 20 minuta na 30 kHz u ultrazvučnom čistaču (model A5120-3YJ) na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon soniciranja, uzorak je centrifugiran na 6000 rpm tijekom 15 minuta. Supernatant je sakupljen, a apsorbancija hipericina izmjerena je na 592 nm pomoću Plus-3000 S spektrofotometra prema metodi koju su opisali Conceiçao i suradnici [14].
Većina tretmana regulatorima rasta biljaka (PGR) i nanočesticama željezovog oksida (Fe₃O₄-NP) nije izazvala stvaranje crnih kvržica na regeneriranim listovima izdanaka. Nisu uočene kvržice ni u jednom od tretmana s 0,5 ili 1 mg/L 2,4-D, 0,5 ili 1 mg/L kinetina ili 1, 2 ili 4 mg/L nanočesticama željezovog oksida. Nekoliko kombinacija pokazalo je blagi porast razvoja kvržica (ali ne statistički značajan) pri višim koncentracijama kinetina i/ili nanočesticama željezovog oksida, kao što je kombinacija 2,4-D (0,5–2 mg/L) s kinitinom (1–1,5 mg/L) i nanočesticama željezovog oksida (2–4 mg/L). Ovi rezultati prikazani su na slici 2. Crne kvržice predstavljaju žlijezde bogate hipericinom, i prirodno prisutne i korisne. U ovoj studiji, crne kvržice uglavnom su bile povezane sa smeđenjem tkiva, što ukazuje na povoljno okruženje za nakupljanje hipericina. Tretman s 2,4-D, kinetinom i Fe₃O₄ nanočesticama potaknuo je rast kalusa, smanjio posmeđivanje i povećao sadržaj klorofila, što sugerira poboljšanu metaboličku funkciju i potencijalno smanjenje oksidativnih oštećenja [37]. Ova studija procijenila je učinke kinetina u kombinaciji s 2,4-D i Fe₃O₄ nanočesticama na rast i razvoj kalusa gospine trave (slika 3a–g). Prethodne studije pokazale su da Fe₃O₄ nanočestice imaju antifungalna i antimikrobna djelovanja [38, 39] te, kada se koriste u kombinaciji s regulatorima rasta biljaka, mogu stimulirati obrambene mehanizme biljaka i smanjiti indekse staničnog stresa [18]. Iako je biosinteza sekundarnih metabolita genetski regulirana, njihov stvarni prinos uvelike ovisi o uvjetima okoliša. Metaboličke i morfološke promjene mogu utjecati na razinu sekundarnih metabolita reguliranjem ekspresije specifičnih biljnih gena i reagiranjem na čimbenike okoliša. Nadalje, induktori mogu pokrenuti aktivaciju novih gena, koji zauzvrat stimuliraju enzimsku aktivnost, što u konačnici aktivira više biosintetskih putova i dovodi do stvaranja sekundarnih metabolita. Nadalje, druga studija pokazala je da smanjenje zasjenjenja povećava izloženost sunčevoj svjetlosti, čime se povisuju dnevne temperature u prirodnom staništu *Hypericum perforatum*, što također doprinosi povećanom prinosu hipericina. Na temelju tih podataka, ova je studija istražila ulogu željeznih nanočestica kao potencijalnih induktora u kulturi tkiva. Rezultati su pokazali da ove nanočestice mogu aktivirati gene uključene u biosintezu hesperidina putem enzimske stimulacije, što dovodi do povećanog nakupljanja ovog spoja (slika 2). Stoga se, u usporedbi s biljkama koje rastu u prirodnim uvjetima, može tvrditi da se proizvodnja takvih spojeva in vivo također može poboljšati kada se umjereni stres kombinira s aktivacijom gena uključenih u biosintezu sekundarnih metabolita. Kombinirani tretmani općenito imaju pozitivan učinak na brzinu regeneracije, ali u nekim slučajevima taj je učinak oslabljen. Značajno je da tretman s 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaze i različitim koncentracijama može neovisno i značajno povećati brzinu regeneracije za 50,85% u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 4c). Ovi rezultati sugeriraju da specifične kombinacije nanohormona mogu sinergijski djelovati kako bi potaknule rast biljaka i proizvodnju metabolita, što je od velikog značaja za kulturu tkiva ljekovitog bilja. Palmer i Keller [50] pokazali su da tretman s 2,4-D može neovisno izazvati stvaranje kalusa u St. perforatum, dok dodatak kinaze značajno poboljšava stvaranje i regeneraciju kalusa. Taj je učinak posljedica poboljšanja hormonske ravnoteže i stimulacije stanične diobe. Bal i sur. [51] otkrili su da tretman s Fe₃O₄-NP može neovisno poboljšati funkciju antioksidativnih enzima, čime se potiče rast korijena u St. perforatum. Mediji za uzgoj koji sadrže Fe₃O₄ nanočestice u koncentracijama od 0,5 mg/L, 1 mg/L i 1,5 mg/L poboljšali su brzinu regeneracije biljaka lana [52]. Upotreba kinetina, 2,4-diklorobenzotiazolinona i Fe₃O₄ nanočestica značajno je poboljšala brzinu stvaranja kalusa i korijena, međutim, potrebno je uzeti u obzir potencijalne nuspojave korištenja ovih hormona za regeneraciju in vitro. Na primjer, dugotrajna ili upotreba 2,4-diklorobenzotiazolinona ili kinetina u visokim koncentracijama može rezultirati somatskim klonskim varijacijama, oksidativnim stresom, abnormalnom morfologijom kalusa ili vitrifikacijom. Stoga visoka stopa regeneracije ne mora nužno predviđati genetsku stabilnost. Sve regenerirane biljke treba procijeniti pomoću molekularnih markera (npr. RAPD, ISSR, AFLP) ili citogenetske analize kako bi se utvrdila njihova homogenost i sličnost s biljkama in vivo [53,54,55].
Ova je studija prvi put pokazala da kombinirana upotreba regulatora rasta biljaka (2,4-D i kinetina) s Fe₃O₄ nanočesticama može poboljšati morfogenezu i akumulaciju ključnih bioaktivnih metabolita (uključujući hipericin i hiperozid) u *Hypericum perforatum*. Optimizirani režim tretmana (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetina + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) ne samo da je maksimizirao stvaranje kalusa, organogenezu i prinos sekundarnih metabolita, već je pokazao i blagi inducirajući učinak, potencijalno poboljšavajući toleranciju biljke na stres i ljekovitu vrijednost. Kombinacija nanotehnologije i kulture biljnog tkiva pruža održivu i učinkovitu platformu za masovnu in vitro proizvodnju ljekovitih spojeva. Ovi rezultati otvaraju put industrijskim primjenama i budućim istraživanjima molekularnih mehanizama, optimizacije doziranja i genetske preciznosti, povezujući time temeljna istraživanja ljekovitog bilja s praktičnom biotehnologijom.
Vrijeme objave: 12. prosinca 2025.