Rast apikalnog meristema izdanka (SAM) kritičan je za arhitekturu stabljike. Biljni hormonigiberelini(GA) igraju ključnu ulogu u koordiniranju rasta biljaka, ali njihova uloga u SAM ostaje slabo shvaćena. Ovdje smo razvili raciometrijski biosenzor GA signaliziranja inženjeringom DELLA proteina da suzbije njegovu bitnu regulatornu funkciju u GA transkripcijskom odgovoru, a istovremeno očuva njegovu degradaciju nakon GA prepoznavanja. Pokazujemo da ovaj biosenzor temeljen na razgradnji točno bilježi promjene u razinama GA i staničnom senzoru tijekom razvoja. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje GA signalne aktivnosti u SAM. Pokazali smo da su visoki GA signali prisutni pretežno u stanicama smještenim između primordija organa, koje su prekursori stanica internodija. Koristeći pristupe dobitka i gubitka funkcije, dalje pokazujemo da GA regulira orijentaciju ravnine stanične diobe, uspostavljajući kanoničku staničnu organizaciju internodija, čime promiče specifikaciju internodija u SAM-u.
Apikalni meristem izdanka (SAM), smješten na vrhu izdanka, sadrži nišu matičnih stanica čija aktivnost generira bočne organe i čvorove stabljike na modularan i iterativni način tijekom cijelog života biljke. Svaka od ovih ponavljajućih jedinica, ili biljnih čvorova, uključuje internodije i bočne organe u čvorovima, te aksilarne meristeme u pazušcima listova1. Rast i organizacija biljnih čvorova mijenja se tijekom razvoja. Kod Arabidopsisa, internodalni rast je potisnut tijekom vegetativnog stadija, a aksilarni meristemi ostaju neaktivni u pazušcima listova rozete. Tijekom prijelaza u fazu cvjetanja, SAM postaje meristem inflorescencije, generirajući izdužene internodije i aksilarne pupoljke, grančice u pazušcima lišća listova, a kasnije i bezlisne cvjetove2. Iako smo značajno napredovali u razumijevanju mehanizama koji kontroliraju pokretanje lišća, cvjetova i grana, relativno malo se zna o tome kako nastaju internodije.
Razumijevanje prostorno-vremenske distribucije GA pomoći će boljem razumijevanju funkcija ovih hormona u različitim tkivima i u različitim razvojnim fazama. Vizualizacija degradacije fuzije RGA-GFP izražene pod djelovanjem vlastitog promotora pruža važne informacije o regulaciji ukupnih razina GA u korijenima15,16. Međutim, ekspresija RGA varira među tkivima17 i regulirana je GA18. Dakle, različita ekspresija RGA promotora može rezultirati uzorkom fluorescencije opaženim s RGA-GFP i stoga ova metoda nije kvantitativna. Nedavno je bioaktivni fluorescein (Fl) obilježen GA19,20 otkrio nakupljanje GA u endokorteksu korijena i regulaciju njegovih staničnih razina transportom GA. Nedavno je GA FRET senzor nlsGPS1 pokazao da su razine GA u korelaciji s produljenjem stanica u korijenju, filamentima i tamnim hipokotilima21. Međutim, kao što smo vidjeli, koncentracija GA nije jedini parametar koji kontrolira aktivnost signalizacije GA, budući da ovisi o složenim procesima osjeta. Ovdje, na temelju našeg razumijevanja DELLA i GA signalnih putova, izvješćujemo o razvoju i karakterizaciji raciometrijskog biosenzora temeljenog na razgradnji za GA signalizaciju. Za razvoj ovog kvantitativnog biosenzora upotrijebili smo mutirani RGA osjetljiv na GA koji je spojen s fluorescentnim proteinom i sveprisutno eksprimiran u tkivima, kao i fluorescentni protein neosjetljiv na GA. Pokazujemo da mutantne fuzije RGA proteina ne ometaju endogeno GA signaliziranje kada se sveprisutno eksprimiraju i da ovaj biosenzor može kvantificirati signalnu aktivnost koja proizlazi iz GA ulaza i obrade GA signala senzornim aparatom s visokom prostorno-vremenskom rezolucijom. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti i kvantificirali kako GA regulira ponašanje stanica u SAM epidermisu. Pokazujemo da GA regulira orijentaciju ravnine diobe SAM stanica smještenih između primordija organa, definirajući tako kanoničku staničnu organizaciju internodija.
Konačno, pitali smo može li qmRGA izvijestiti o promjenama u endogenim razinama GA koristeći rastuće hipokotile. Prethodno smo pokazali da nitrat stimulira rast povećavajući sintezu GA i, zauzvrat, razgradnju DELLA34. Sukladno tome, primijetili smo da je duljina hipokotila u pUBQ10::qmRGA sadnicama uzgojenim pod obilnom opskrbom nitratima (10 mM NO3−) bila značajno duža od one u sadnicama uzgojenim u uvjetima nedostatka nitrata (dodatna slika 6a). U skladu s odgovorom rasta, GA signali bili su viši u hipokotilima sadnica uzgojenih pod 10 mM NO3- uvjetima nego u sadnicama uzgojenim u odsutnosti nitrata (dodatna slika 6b, c). Stoga qmRGA također omogućuje praćenje promjena u signalizaciji GA izazvanih endogenim promjenama u koncentraciji GA.
Kako bismo razumjeli ovisi li aktivnost GA signalizacije koju detektira qmRGA o koncentraciji GA i percepciji GA, kao što se očekuje na temelju dizajna senzora, analizirali smo ekspresiju tri GID1 receptora u vegetativnim i reproduktivnim tkivima. U sadnicama, reporterska linija GID1-GUS pokazala je da su GID1a i c bili visoko izraženi u kotiledonima (Slika 3a-c). Osim toga, sva tri receptora izražena su u listovima, bočnim korijenskim primordijama, vrhovima korijena (osim korijenske kapice GID1b) i vaskularnom sustavu (Slika 3a-c). U SAM cvatu detektirali smo GUS signale samo za GID1b i 1c (dodatna slika 7a–c). Hibridizacija in situ potvrdila je ove obrasce ekspresije i dodatno pokazala da je GID1c ravnomjerno izražen na niskim razinama u SAM-u, dok je GID1b pokazao veću ekspresiju na periferiji SAM-a (dopunska slika 7d-l). Translacijska fuzija pGID1b::2xmTQ2-GID1b također je otkrila stupnjevani raspon ekspresije GID1b, od niske ili nikakve ekspresije u središtu SAM-a do visoke ekspresije na granicama organa (dodatna slika 7m). Dakle, GID1 receptori nisu ravnomjerno raspoređeni po i unutar tkiva. U pokusima koji su uslijedili, također smo primijetili da je prekomjerna ekspresija GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) povećala osjetljivost qmRGA u hipokotilima na vanjsku primjenu GA (Slika 3d, e). Nasuprot tome, fluorescencija mjerena pomoću qd17mRGA u hipokotilu bila je neosjetljiva na tretman GA3 (Sl. 3f, g). Za oba testa, sadnice su tretirane visokim koncentracijama GA (100 μM GA3) kako bi se procijenilo brzo ponašanje senzora, gdje je sposobnost vezanja na GID1 receptor bila poboljšana ili izgubljena. Zajedno, ovi rezultati potvrđuju da biosenzor qmRGA služi kombiniranoj funkciji kao GA i GA senzor i sugeriraju da diferencijalna ekspresija GID1 receptora može značajno modulirati emisivnost senzora.
Do danas je distribucija GA signala u SAM-u ostala nejasna. Stoga smo koristili biljke koje eksprimiraju qmRGA i reporter matičnih stanica pCLV3::mCherry-NLS35 za izračunavanje kvantitativnih mapa visoke rezolucije signalne aktivnosti GA, usredotočujući se na sloj L1 (epidermis; slika 4a, b, vidi metode i dopunske metode), budući da L1 igra ključnu ulogu u kontroli rasta SAM-a36. Ovdje je ekspresija pCLV3::mCherry-NLS pružila fiksnu geometrijsku referentnu točku za analizu prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti37. Iako se GA smatra bitnim za razvoj bočnih organa4, primijetili smo da su GA signali bili niski u cvjetnom primordiju (P) počevši od faze P3 (Slika 4a, b), dok su mladi P1 i P2 primordiji imali umjerenu aktivnost sličnu onoj u središnjem području (Slika 4a, b). Veća aktivnost signaliziranja GA otkrivena je na granicama primordija organa, počevši od P1/P2 (na stranama granice) i dostižući vrhunac na P4, kao i u svim stanicama periferne regije smještene između primordija (Slika 4a, b i Dodatna slika 8a, b). Ova viša aktivnost signaliziranja GA primijećena je ne samo u epidermisu, već iu L2 i gornjim L3 slojevima (dodatna slika 8b). Uzorak GA signala otkrivenih u SAM-u pomoću qmRGA također je ostao nepromijenjen tijekom vremena (dodatna slika 8c–f, k). Iako je konstrukt qd17mRGA sustavno smanjen u SAM-u T3 biljaka iz pet neovisnih linija koje smo detaljno okarakterizirali, uspjeli smo analizirati uzorke fluorescencije dobivene konstruktom pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (dodatna slika 8g–j, l). U ovoj kontrolnoj liniji otkrivene su samo manje promjene u omjeru fluorescencije u SAM-u, ali u SAM centru primijetili smo jasno i neočekivano smanjenje VENUS-a povezanog s TagBFP-om. Ovo potvrđuje da signalni obrazac promatran pomoću qmRGA odražava degradaciju mRGA-VENUS ovisnu o GA, ali također pokazuje da qmRGA može precijeniti GA signalnu aktivnost u centru meristema. Ukratko, naši rezultati otkrivaju GA signalni obrazac koji prvenstveno odražava distribuciju primordija. Ova raspodjela inter-primordijalne regije (IPR) posljedica je postupnog uspostavljanja visoke GA signalne aktivnosti između primordija u razvoju i središnje regije, dok se u isto vrijeme GA signalna aktivnost u primordiju smanjuje (Sl. 4c, d).
Distribucija GID1b i GID1c receptora (vidi gore) sugerira da diferencijalna ekspresija GA receptora pomaže oblikovati obrazac GA signalne aktivnosti u SAM. Pitali smo se može li biti uključeno diferencijalno nakupljanje GA. Kako bismo istražili ovu mogućnost, koristili smo nlsGPS1 GA FRET senzor21. Povećana učestalost aktivacije otkrivena je u SAM-u nlsGPS1 tretiranom s 10 μM GA4+7 tijekom 100 minuta (dodatna slika 9a–e), što ukazuje da nlsGPS1 reagira na promjene u koncentraciji GA u SAM-u, kao što to čini u korijenima21. Prostorna raspodjela frekvencije aktivacije nlsGPS1 otkrila je relativno niske razine GA u vanjskim slojevima SAM-a, ali je pokazala da su povišene u središtu i na granicama SAM-a (Slika 4e i Dodatna slika 9a,c). Ovo sugerira da je GA također distribuiran u SAM-u s prostornim uzorkom usporedivim s onim koji otkriva qmRGA. Kao komplementarni pristup, također smo tretirali SAM s fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ili samo Fl kao negativnu kontrolu. Fl signal je bio distribuiran kroz SAM, uključujući središnje područje i primordij, iako nižim intenzitetom (Slika 4j i Dodatna slika 10d). Nasuprot tome, sva tri GA-Fl akumulirala su se specifično unutar granica primordija i u različitim stupnjevima u ostatku IPR-a, pri čemu se GA7-Fl nakupljao u najvećoj domeni u IPR-u (Slika 4k i Dodatna slika 10a,b). Kvantifikacija intenziteta fluorescencije otkrila je da je omjer intenziteta IPR prema ne-IPR bio viši u SAM-u tretiranom s GA-Fl u usporedbi s SAM-om tretiranim s Fl (Slika 4l i Dodatna slika 10c). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je GA prisutan u višim koncentracijama u IPR stanicama koje se nalaze najbliže granici organa. Ovo sugerira da obrazac SAM GA signalne aktivnosti proizlazi iz različite ekspresije GA receptora i diferencijalne akumulacije GA u IPR stanicama blizu granica organa. Stoga je naša analiza otkrila neočekivan prostorno-vremenski obrazac GA signalizacije, s nižom aktivnošću u središtu i primordijumu SAM-a i većom aktivnošću u IPR-u u perifernoj regiji.
Kako bismo razumjeli ulogu diferencijalne GA signalne aktivnosti u SAM-u, analizirali smo korelaciju između GA signalne aktivnosti, stanične ekspanzije i stanične diobe koristeći snimanje u stvarnom vremenu SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. S obzirom na ulogu GA u regulaciji rasta, očekivana je pozitivna korelacija s parametrima stanične ekspanzije. Stoga smo prvo usporedili karte aktivnosti signalizacije GA s kartama brzine rasta stanične površine (kao zamjena za snagu stanične ekspanzije za danu stanicu i za stanice kćeri pri diobi) i s kartama anizotropije rasta, koja mjeri usmjerenost stanične ekspanzije (također se ovdje koristi za danu stanicu i za stanice kćeri pri diobi; slika 5a,b, vidi metode i dopunske metode). Naše karte stope rasta površine stanica SAM u skladu su s prethodnim opažanjima38,39, s minimalnim stopama rasta na granici i maksimalnim stopama rasta u cvjetovima u razvoju (Sl. 5a). Analiza glavne komponente (PCA) pokazala je da je aktivnost signalizacije GA bila u negativnoj korelaciji s intenzitetom rasta stanične površine (Slika 5c). Također smo pokazali da su glavne osi varijacije, uključujući ulaz GA signalizacije i intenzitet rasta, bile okomite na smjer određen visokom ekspresijom CLV3, potvrđujući isključenje stanica iz SAM centra u preostalim analizama. Spearmanova analiza korelacije potvrdila je rezultate PCA (Slika 5d), pokazujući da viši GA signali u IPR-u nisu rezultirali većom ekspanzijom stanica. Međutim, korelacijska analiza otkrila je blagu pozitivnu korelaciju između aktivnosti signalizacije GA i anizotropije rasta (Slika 5c, d), što sugerira da veća signalizacija GA u IPR-u utječe na smjer rasta stanica i vjerojatno na položaj ravnine stanične diobe.
a, b Toplinske karte srednjeg površinskog rasta (a) i anizotropije rasta (b) u SAM u prosjeku za sedam neovisnih biljaka (korištene kao zamjenske vrijednosti za snagu i smjer širenja stanica). c PCA analiza uključivala je sljedeće varijable: GA signal, intenzitet površinskog rasta, anizotropiju površinskog rasta i ekspresiju CLV3. PCA komponenta 1 bila je uglavnom u negativnoj korelaciji s intenzitetom površinskog rasta i pozitivnoj korelaciji s GA signalom. PCA komponenta 2 uglavnom je bila u pozitivnoj korelaciji s anizotropijom površinskog rasta i u negativnoj korelaciji s ekspresijom CLV3. Postoci predstavljaju varijaciju objašnjenu svakom komponentom. d Spearmanova analiza korelacije između GA signala, intenziteta površinskog rasta i anizotropije površinskog rasta na skali tkiva isključujući CZ. Broj s desne strane je Spearmanova rho vrijednost između dvije varijable. Zvjezdice označavaju slučajeve u kojima je korelacija/negativna korelacija vrlo značajna. e 3D vizualizacija Col-0 SAM L1 stanica konfokalnom mikroskopijom. Nove stanične stijenke formirane u SAM-u (ali ne i primordiju) nakon 10 h obojene su prema vrijednostima kuta. Traka boja prikazana je u donjem desnom kutu. Umetak prikazuje odgovarajuću 3D sliku na 0 h. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. f Okvirni dijagrami prikazuju stope diobe stanica u IPR i ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 neovisnih biljaka). Središnja linija prikazuje medijan, a granice okvira označavaju 25. i 75. percentil. Brkovi označavaju minimalne i maksimalne vrijednosti određene R softverom. P vrijednosti dobivene su Welchovim dvostranim t-testom. g, h Shematski dijagram koji prikazuje (g) kako izmjeriti kut nove stanične stijenke (magenta) u odnosu na radijalni smjer od središta SAM-a (bijela točkasta linija) (razmatraju se samo vrijednosti oštrog kuta, tj. 0–90°), i (h) obodni/bočni i radijalni smjer unutar meristema. i Frekvencijski histogrami orijentacije ravnine stanične diobe preko SAM (tamnoplava), IPR (srednje plava), odnosno ne-IPR (svijetloplava). P vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. j Frekvencijski histogrami orijentacije ravnine stanične diobe IPR-a oko P3 (svijetlozeleno), P4 (srednjezeleno), odnosno P5 (tamnozeleno). P vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima.
Stoga smo zatim istražili korelaciju između GA signalizacije i aktivnosti stanične diobe identificiranjem novoformiranih staničnih stijenki tijekom testa (Slika 5e). Ovaj nam je pristup omogućio mjerenje učestalosti i smjera diobe stanica. Iznenađujuće, otkrili smo da je učestalost staničnih dioba u IPR i ostatku SAM (ne-IPR, slika 5f) slična, što ukazuje da razlike u GA signalizaciji između IPR i ne-IPR stanica ne utječu značajno na staničnu diobu. Ovo, i pozitivna korelacija između GA signalizacije i anizotropije rasta, potaknulo nas je da razmotrimo može li aktivnost GA signalizacije utjecati na orijentaciju ravnine stanične diobe. Mjerili smo orijentaciju nove stanične stijenke kao oštri kut u odnosu na radijalnu os koja povezuje središte meristema i središte nove stanične stijenke (Sl. 5e-i) i uočili jasnu tendenciju dijeljenja stanica pod kutovima blizu 90° u odnosu na radijalnu os, s najvišim učestalostima uočenim na 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (Sl. 5e,i), što odgovara diobama stanica u obodnom/poprečnom smjeru (Sl. 5h). Kako bismo ispitali doprinos GA signaliziranja ovom ponašanju stanične diobe, zasebno smo analizirali parametre stanične diobe u IPR-u i ne-IPR-u (slika 5i). Uočili smo da se distribucija kuta podjele u IPR stanicama razlikuje od one u ne-IPR stanicama ili u stanicama u cijelom SAM-u, pri čemu IPR stanice pokazuju veći udio bočnih/kružnih staničnih dioba, tj. 70–80° i 80–90° (33,86% odnosno 30,71%, odgovarajući udjeli) (Slika 5i). Stoga su naša opažanja otkrila povezanost između visoke GA signalizacije i orijentacije ravnine stanične diobe blizu obodnog smjera, slično korelaciji između GA signalne aktivnosti i anizotropije rasta (Sl. 5c, d). Kako bismo dodatno utvrdili prostornu očuvanost ove povezanosti, izmjerili smo orijentaciju ravnine podjele u IPR stanicama koje okružuju primordij počevši od P3, budući da je najveća aktivnost GA signalizacije otkrivena u ovoj regiji počevši od P4 (Sl. 4). Kutovi diobe IPR-a oko P3 i P4 nisu pokazali statistički značajne razlike, iako je uočena povećana učestalost bočnih dioba stanica u IPR-u oko P4 (slika 5j). Međutim, u IPR stanicama oko P5, razlika u orijentaciji ravnine stanične diobe postala je statistički značajna, s naglim povećanjem učestalosti poprečnih staničnih dioba (Sl. 5j). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GA signalizacija može kontrolirati orijentaciju staničnih dioba u SAM-u, što je u skladu s prethodnim izvješćima40,41 da visoka GA signalizacija može inducirati lateralnu orijentaciju staničnih dioba u IPR-u.
Predviđa se da stanice u IPR-u neće biti ugrađene u primordije, već u internodije 2,42,43. Poprečna orijentacija staničnih dioba u IPR-u može rezultirati tipičnom organizacijom paralelnih uzdužnih redova epidermalnih stanica u internodijama. Naša opažanja opisana gore sugeriraju da GA signalizacija vjerojatno igra ulogu u ovom procesu reguliranjem smjera stanične diobe.
Gubitak funkcije nekoliko DELLA gena rezultira konstitutivnim GA odgovorom, a della mutanti se mogu koristiti za testiranje ove hipoteze44. Prvo smo analizirali obrasce ekspresije pet DELLA gena u SAM. Transkripcijska fuzija GUS linije45 otkrila je da su GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (u mnogo manjoj mjeri) izraženi u SAM-u (dodatna slika 11a-d). Hibridizacija in situ dodatno je pokazala da se GAI mRNA nakuplja posebno u primordiji i cvjetovima u razvoju (dodatna slika 11e). RGL1 i RGL3 mRNA otkrivene su u cijeloj krošnji SAM-a i u starijim cvjetovima, dok je RGL2 mRNA bila obilnija u rubnom području (dodatna slika 11f-h). Konfokalna slika pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdila je ekspresiju uočenu in situ hibridizacijom i pokazala da se protein RGL3 nakuplja u središnjem dijelu SAM (dodatna slika 11i). Koristeći liniju pRGA::GFP-RGA, također smo otkrili da se RGA protein nakuplja u SAM, ali njegova brojnost opada na granici počevši od P4 (dodatna slika 11j). Značajno je da su obrasci ekspresije RGL3 i RGA u skladu s većom aktivnošću GA signalizacije u IPR-u, kako je detektirano pomoću qmRGA (Slika 4). Štoviše, ovi podaci pokazuju da su sve DELLA izražene u SAM-u i da njihov izraz kolektivno obuhvaća cijeli SAM.
Zatim smo analizirali parametre stanične diobe u divljem tipu SAM (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della petostrukih (globalnih) mutanata (Sl. 6a, b). Zanimljivo je da smo uočili statistički značajan pomak u distribuciji frekvencija kutova stanične diobe u della global mutant SAM u usporedbi s divljim tipom (slika 6c). Ova promjena u mutantu della global nastala je zbog povećanja učestalosti kutova od 80–90° (34,71% prema 24,55%) i, u manjoj mjeri, kutova od 70–80° (23,78% prema 20,18%), tj. što odgovara poprečnim diobama stanica (Slika 6c). Učestalost nepoprečnih podjela (0-60°) također je bila niža u mutantu della global (slika 6c). Učestalost poprečnih staničnih dioba značajno je povećana u SAM mutanta della global (slika 6b). Učestalost poprečnih staničnih dioba u IPR-u također je bila veća u mutantu della global u usporedbi s divljim tipom (slika 6d). Izvan područja IPR-a, divlji tip imao je ujednačeniju raspodjelu kutova stanične diobe, dok je mutant della global preferirao tangencijalne podjele poput IPR-a (slika 6e). Također smo kvantificirali orijentaciju staničnih dioba u SAM-u peterostrukih mutanata ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), GA-neaktivne mutantne pozadine u kojoj se GA nakuplja. U skladu s povećanjem razina GA, SAM petostrukog ga2ox mutantnog cvata bio je veći od onog kod Col-0 (dopunska slika 12a, b), a u usporedbi s Col-0, petostruki ga2ox SAM pokazao je izrazito drugačiju distribuciju kutova stanične diobe, s frekvencijom kuta koja se povećala od 50° do 90°, tj. opet u korist tangencijalne podjele (dodatna slika 12a–c). Stoga pokazujemo da konstitutivna aktivacija GA signalizacije i nakupljanje GA inducira bočne diobe stanica u IPR-u i ostatku SAM-a.
a, b 3D vizualizacija L1 sloja Ler (a) i globalnog della mutanta (b) SAM-a obojenog PI pomoću konfokalne mikroskopije. Nove stanične stijenke nastale u SAM-u (ali ne i primordiju) tijekom razdoblja od 10 sati prikazane su i obojene u skladu s njihovim kutnim vrijednostima. Umetak prikazuje SAM u 0 h. Traka boja prikazana je u donjem desnom kutu. Strelica u (b) pokazuje na primjer poravnatih datoteka stanica u globalnom della mutantu. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. ce usporedba distribucije frekvencije orijentacije ravnine stanične diobe u cijelom SAM-u (d), IPR-u (e) i ne-IPR-u (f) između Ler i globalne della. P vrijednosti dobivene su korištenjem dvostranog Kolmogorov-Smirnovljevog testa. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slika PI-obojenog SAM-a Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenih biljaka. Ploče (a, b) prikazuju nove stanične stijenke (ali ne i primordije) formirane u SAM unutar 10 h. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. h–j Usporedba distribucije učestalosti orijentacije ravnine stanične diobe locirane u cijelom SAM (h), IPR (i) i ne-IPR (j) između biljaka Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. P vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov–Smirnovljevim testom.
Zatim smo testirali učinak inhibicije GA signalizacije posebno u IPR-u. U tu smo svrhu upotrijebili promotor čašice kotiledona 2 (CUC2) za pokretanje ekspresije dominantnog negativnog gai-1 proteina spojenog s VENUS (u liniji pCUC2::gai-1-VENUS). U divljem tipu SAM-a, promotor CUC2 pokreće ekspresiju većine IPR-ova u SAM-u, uključujući granične stanice, od P4 nadalje, a slična specifična ekspresija primijećena je u biljkama pCUC2::gai-1-VENUS (vidi dolje). Distribucija kutova stanične diobe kroz SAM ili IPR biljaka pCUC2::gai-1-VENUS nije se značajno razlikovala od one kod divljeg tipa, iako smo neočekivano otkrili da se stanice bez IPR-a u tim biljkama dijele na višoj frekvenciji od 80-90° (Slika 6f-j).
Predloženo je da smjer diobe stanica ovisi o geometriji SAM-a, posebno o vlačnom naprezanju koje stvara zakrivljenost tkiva46. Stoga smo pitali je li oblik SAM-a promijenjen u della global mutantu i biljkama pCUC2::gai-1-VENUS. Kao što je ranije objavljeno12, veličina della globalnog mutantnog SAM-a bila je veća od veličine divljeg tipa (Dodatna slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 i STM RNA potvrdila je ekspanziju meristema u della mutantima i dodatno pokazala lateralnu ekspanziju niše matične stanice (dodatna slika 13e, f, h, i). Međutim, zakrivljenost SAM bila je slična u oba genotipa (dodatna slika 13k, m, n, p). Uočili smo slično povećanje veličine u četverostrukom mutantu gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della bez promjene zakrivljenosti u usporedbi s divljim tipom (dodatna slika 13c, d, g, j, l, o, p). Učestalost orijentacije stanične diobe također je bila pogođena u della četverostrukom mutantu, ali u manjoj mjeri nego u della monolitnom mutantu (dodatna slika 12d-f). Ovaj učinak doziranja, zajedno s nedostatkom učinka na zakrivljenost, sugerira da rezidualna aktivnost RGL3 u četverostrukom mutantu Della ograničava promjene u orijentaciji stanične diobe uzrokovane gubitkom aktivnosti DELLA i da se promjene u bočnim diobama stanica događaju kao odgovor na promjene u GA signalnoj aktivnosti, a ne na promjene u geometriji SAM. Kao što je gore opisano, promotor CUC2 pokreće ekspresiju IPR-a u SAM-u počevši od P4 (dodatna slika 14a, b), a nasuprot tome, pCUC2::gai-1-VENUS SAM imao je smanjenu veličinu, ali veću zakrivljenost (dodatna slika 14c–h). Ova promjena u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM može rezultirati drugačijom raspodjelom mehaničkih naprezanja u usporedbi s divljim tipom, u kojem velika obodna naprezanja počinju na kraćoj udaljenosti od središta SAM-a47. Alternativno, promjene u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM mogu biti rezultat promjena u regionalnim mehaničkim svojstvima izazvanim ekspresijom transgena48. U oba slučaja, ovo bi moglo djelomično neutralizirati učinke promjena u GA signalizaciji povećanjem vjerojatnosti da će se stanice podijeliti u perifernoj/poprečnoj orijentaciji, objašnjavajući naša opažanja.
Uzeti zajedno, naši podaci potvrđuju da viša GA signalizacija igra aktivnu ulogu u bočnoj orijentaciji ravnine stanične diobe u IPR-u. Oni također pokazuju da zakrivljenost meristema također utječe na orijentaciju ravnine stanične diobe u IPR-u.
Poprečna orijentacija ravnine podjele u IPR-u, zbog visoke aktivnosti GA signalizacije, sugerira da GA unaprijed organizira radijalnu staničnu datoteku u epidermisu unutar SAM-a kako bi se definirala stanična organizacija koja će se kasnije naći u epidermalnom internodiju. Doista, takve su stanične datoteke bile često vidljive na SAM slikama della globalnih mutanata (slika 6b). Stoga, kako bismo dodatno istražili razvojnu funkciju prostornog obrasca GA signalizacije u SAM-u, upotrijebili smo snimanje s vremenskim odmakom za analizu prostorne organizacije stanica u IPR-u u divljem tipu (Ler i Col-0), della globalnim mutantima i pCUC2::gai-1-VENUS transgenim biljkama.
Otkrili smo da je qmRGA pokazao da se aktivnost GA signaliziranja u IPR-u povećala od P1/P2 i dosegla vrhunac na P4, a ovaj je uzorak ostao konstantan tijekom vremena (Slika 4a–f i Dodatna slika 8c–f, k). Kako bismo analizirali prostornu organizaciju stanica u IPR-u s povećanjem GA signala, označili smo Ler IPR stanice iznad i sa strane P4 prema njihovoj razvojnoj sudbini analiziranoj 34 sata nakon prvog promatranja, tj. više od dva puta plastida, što nam omogućuje da pratimo IPR stanice tijekom razvoja primordija od P1/P2 do P4. Koristili smo tri različite boje: žutu za one stanice koje su integrirane u primordij u blizini P4, zelenu za one koje su bile u IPR-u i ljubičastu za one koje su sudjelovale u oba procesa (Sl. 7a-c). U t0 (0 h), 1-2 sloja IPR stanica bila su vidljiva ispred P4 (Sl. 7a). Kao što se i očekivalo, kada su se te stanice podijelile, učinile su to uglavnom preko poprečne ravnine diobe (Slike 7a–c). Slični rezultati dobiveni su korištenjem Col-0 SAM (fokusirajući se na P3, čija se granica savija slično P4 u Ler), iako je u ovom genotipu nabor formiran na cvjetnoj granici brže skrivao IPR stanice (Sl. 7g-i). Dakle, obrazac dijeljenja IPR stanica unaprijed organizira stanice u radijalne redove, kao u internodijama. Organizacija radijalnih redova i lokalizacija IPR stanica između uzastopnih organa sugerira da su te stanice internodalni progenitori.
Ovdje smo razvili raciometrijski GA signalni biosenzor, qmRGA, koji omogućuje kvantitativno mapiranje GA signalne aktivnosti koja proizlazi iz kombiniranih koncentracija GA i GA receptora, a istovremeno minimizira interferenciju s endogenim signalnim putovima, čime se pružaju informacije o funkciji GA na staničnoj razini. U tu smo svrhu konstruirali modificirani DELLA protein, mRGA, koji je izgubio sposobnost vezanja DELLA interakcijskih partnera, ali ostaje osjetljiv na proteolizu izazvanu GA. qmRGA reagira i na egzogene i na endogene promjene u razinama GA, a njegova svojstva dinamičkog senzora omogućuju procjenu prostorno-vremenskih promjena u GA signalnoj aktivnosti tijekom razvoja. qmRGA je također vrlo fleksibilan alat jer se može prilagoditi različitim tkivima promjenom promotora koji se koristi za njegovu ekspresiju (ako je potrebno), a s obzirom na očuvanu prirodu GA signalnog puta i PFYRE motiva preko angiospermi, vjerojatno će se moći prenijeti na druge vrste22. U skladu s tim, također se pokazalo da ekvivalentna mutacija u proteinu SLR1 DELLA riže (HYY497AAA) potiskuje aktivnost represora rasta SLR1 dok samo malo smanjuje njegovu razgradnju posredovanu GA, slično mRGA23. Naime, nedavne studije na Arabidopsisu pokazale su da je jedna mutacija aminokiseline u PFYRE domeni (S474L) promijenila transkripcijsku aktivnost RGA bez utjecaja na njegovu sposobnost interakcije s partnerima transkripcijskih faktora50. Iako je ova mutacija vrlo bliska supstituciji 3 aminokiseline prisutne u mRGA, naše studije pokazuju da ove dvije mutacije mijenjaju različite karakteristike DELLA-e. Iako se većina partnera transkripcijskih faktora veže za LHR1 i SAW domene DELLA26,51, neke očuvane aminokiseline u PFYRE domeni mogu pomoći u stabilizaciji ovih interakcija.
Razvoj internodija je ključna značajka u arhitekturi biljke i poboljšanju prinosa. qmRGA je otkrio veću aktivnost GA signalizacije u IPR internodijskim progenitorskim stanicama. Kombinacijom kvantitativnog snimanja i genetike, pokazali smo da GA signalni obrasci postavljaju kružne/poprečne ravnine stanične diobe u SAM epidermisu, oblikujući organizaciju stanične diobe potrebnu za razvoj internodija. Tijekom razvoja identificirano je nekoliko regulatora orijentacije ravnine stanične diobe52,53. Naš rad pruža jasan primjer kako aktivnost GA signalizacije regulira ovaj stanični parametar. DELLA može stupiti u interakciju s predsavijajućim proteinskim kompleksima41, tako da GA signalizacija može regulirati orijentaciju ravnine stanične diobe izravnim utjecajem na orijentaciju kortikalnih mikrotubula40,41,54,55. Neočekivano smo pokazali da u SAM-u korelacija veće signalne aktivnosti GA nije produljenje ili dioba stanice, već samo anizotropija rasta, što je u skladu s izravnim učinkom GA na smjer stanične diobe u IPR-u. Međutim, ne možemo isključiti da bi ovaj učinak također mogao biti neizravan, na primjer posredovan GA-induciranim omekšavanjem stanične stijenke56. Promjene u svojstvima stanične stijenke induciraju mehanički stres57,58, koji također može utjecati na orijentaciju ravnine stanične diobe utječući na orijentaciju kortikalnih mikrotubula39,46,59. Kombinirani učinci GA-induciranog mehaničkog stresa i izravne regulacije orijentacije mikrotubula pomoću GA mogu biti uključeni u stvaranje specifičnog obrasca orijentacije stanične diobe u IPR-u za definiranje internodija, a potrebna su daljnja istraživanja kako bi se ispitala ova ideja. Slično, prethodne studije su istaknule važnost proteina TCP14 i 15 koji međusobno djeluju na DELLA u kontroli formiranja internodija60,61 i ti čimbenici mogu posredovati u djelovanju GA zajedno s BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), koji reguliraju razvoj internodija i pokazalo se da utječu na GA signalizaciju2,62. S obzirom da DELLA stupaju u interakciju s signalnim putovima brasinosteroida, etilena, jasmonske kiseline i apscizinske kiseline (ABA)63,64 i da ti hormoni mogu utjecati na orijentaciju mikrotubula65, učinci GA na orijentaciju stanične diobe također mogu biti posredovani drugim hormonima.
Rane citološke studije pokazale su da su i unutarnje i vanjske regije Arabidopsis SAM potrebne za razvoj internodija2,42. Činjenica da GA aktivno regulira diobu stanica u unutarnjim tkivima12 podržava dvostruku funkciju GA u regulaciji veličine meristema i internodija u SAM. Obrazac usmjerene stanične diobe također je čvrsto reguliran u unutarnjem SAM tkivu, a ta je regulacija ključna za rast stabljike52. Bit će zanimljivo ispitati igra li GA i ulogu u usmjeravanju ravnine stanične diobe u unutarnjoj organizaciji SAM-a, sinkronizirajući na taj način specifikaciju i razvoj internodija unutar SAM-a.
Biljke su uzgajane in vitro u tlu ili 1x Murashige-Skoog (MS) mediju (Duchefa) s dodatkom 1% saharoze i 1% agara (Sigma) u standardnim uvjetima (16 h svjetla, 22 °C), osim eksperimenata rasta hipokotila i korijena u kojima su sadnice uzgajane na okomitim pločama pod stalnim svjetlom i 22 °C. Za pokuse s nitratima, biljke su uzgajane na modificiranom MS mediju (biljni medij bioWORLD) s dodatkom odgovarajućeg nitrata (0 ili 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1% saharoze i 1% A-agara (Sigma) u uvjetima dugog dana.
GID1a cDNA umetnuta u pDONR221 rekombinirana je s pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry u pB7m34GW kako bi se stvorio pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA umetnuta u pDONR221 je rekombinirana u pB7RWG266 da se stvori p35S:IDD2-RFP. Za generiranje pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragment od 3,9 kb uzvodno od GID1b kodirajuće regije i fragment od 4,7 kb koji sadrži GID1b cDNA (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) prvo su amplificirani upotrebom početnica u Dodatnoj tablici 3, a zatim umetnuti u pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) odnosno pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), te konačno rekombiniran s pDONR221 2xmTQ268 u pGreen 012567 ciljni vektor korištenjem Gateway kloniranja. Za generiranje pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotorska sekvenca (3229 bp uzvodno od ATG) praćena kodirajućom sekvencom velikog Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 sa N7 nuklearnim lokalizacijskim signalom i NOS transkripcijskim terminatorom sastavljena je u vektor za ciljanje kanamicina pGreen pomoću Gateway 3-fragment rekombinacijskog sustava (Invitrogen). Biljni binarni vektor uveden je u soj Agrobacterium tumefaciens GV3101 i uveden u listove Nicotiane benthamiane metodom infiltracije s Agrobacteriumom, odnosno u Arabidopsis thaliana Col-0 metodom floralnog uranjanja. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA izolirani su iz F3 i F1 potomaka odgovarajućih križanja.
Hibridizacija RNA in situ izvedena je na približno 1 cm dugim vrhovima izdanaka72, koji su sakupljeni i odmah fiksirani u otopini FAA (3,7% formaldehida, 5% octene kiseline, 50% etanola) prethodno ohlađenoj na 4 °C. Nakon 2 × 15 min tretmana vakuumom, fiksativ je promijenjen i uzorci su inkubirani preko noći. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 cDNA i antisens sonde za njihove 3'-UTR sintetizirane su pomoću početnica prikazanih u Dodatnoj tablici 3 kako su opisali Rosier et al.73. Probe obilježene digoksigeninom imunodetektirane su upotrebom antitijela za digoksigenin (3000-struko razrjeđenje; Roche, kataloški broj: 11 093 274 910), a rezovi su obojeni 5-brom-4-klor-3-indolil fosfatom (BCIP, 250-struko razrjeđenje)/nitroplavim tetrazolijem (NBT, 200-struko razrjeđenje) otopina.
Vrijeme objave: 10. veljače 2025