Rast apikalnog meristema (SAM) izdanka ključan je za arhitekturu stabljike. Biljni hormonigiberelini(GA) igraju ključnu ulogu u koordinaciji rasta biljaka, ali njihova uloga u SAM-u (samoustanskoj aminokiselini) još uvijek je slabo shvaćena. Ovdje smo razvili raciometrijski biosenzor GA signalizacije inženjeringom PELL proteina kako bismo potisnuli njegovu esencijalnu regulatornu funkciju u transkripcijskom odgovoru GA, a istovremeno sačuvali njegovu degradaciju nakon prepoznavanja GA. Pokazujemo da ovaj biosenzor temeljen na degradaciji točno bilježi promjene u razinama GA i staničnom osjećanju tijekom razvoja. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje aktivnosti GA signalizacije u SAM-u. Pokazujemo da su visoki GA signali prisutni pretežno u stanicama smještenim između primordija organa, koje su prekursori stanica internodija. Koristeći pristupe dobitka i gubitka funkcije, dodatno pokazujemo da GA regulira orijentaciju ravnine diobe stanica, uspostavljajući kanonsku staničnu organizaciju internodija, čime potiče specifikaciju internodija u SAM-u.
Apikalni meristem izdanka (SAM), smješten na vrhu izdanka, sadrži nišu matičnih stanica čija aktivnost generira bočne organe i čvorove stabljike na modularan i iterativan način tijekom cijelog života biljke. Svaka od ovih ponavljajućih jedinica ili biljnih čvorova uključuje internodije i bočne organe na čvorovima te aksilarne meristeme u pazušcu lista1. Rast i organizacija biljnih čvorova mijenjaju se tijekom razvoja. Kod Arabidopsis, rast internodija je potisnut tijekom vegetativne faze, a aksilarni meristemi ostaju mirujući u pazušcu listova rozete. Tijekom prijelaza u cvjetnu fazu, SAM postaje cvatni meristem, stvarajući izdužene internodije i aksilarne pupoljke, grančice u pazušcu stabljičnih listova, a kasnije i cvjetove bez lišća2. Iako smo postigli značajan napredak u razumijevanju mehanizama koji kontroliraju nastanak lišća, cvjetova i grana, relativno se malo zna o tome kako nastaju internodiji.
Razumijevanje prostorno-vremenske distribucije GA pomoći će u boljem razumijevanju funkcija tih hormona u različitim tkivima i u različitim razvojnim fazama. Vizualizacija degradacije RGA-GFP fuzije eksprimirane pod djelovanjem vlastitog promotora pruža važne informacije o regulaciji ukupnih razina GA u korijenju15,16. Međutim, ekspresija RGA varira među tkivima17 i regulirana je pomoću GA18. Dakle, diferencijalna ekspresija RGA promotora može rezultirati fluorescentnim uzorkom koji se opaža s RGA-GFP te stoga ova metoda nije kvantitativna. Nedavno je bioaktivni fluoresceinom (Fl) obilježeni GA19,20 otkrio akumulaciju GA u endokorteksu korijena i regulaciju njegovih staničnih razina transportom GA. Nedavno je GA FRET senzor nlsGPS1 pokazao da razine GA koreliraju s izduženjem stanica u korijenju, filamentima i tamno uzgojenim hipokotilima21. Međutim, kao što smo vidjeli, koncentracija GA nije jedini parametar koji kontrolira aktivnost GA signalizacije, jer ovisi o složenim procesima osjeta. Ovdje, nadograđujući naše razumijevanje signalnih puteva PELL-a i GA, izvještavamo o razvoju i karakterizaciji raciometrijskog biosenzora za GA signalizaciju temeljenog na degradaciji. Za razvoj ovog kvantitativnog biosenzora koristili smo mutantni RGA osjetljiv na GA koji je bio spojen s fluorescentnim proteinom i sveprisutno eksprimiran u tkivima, kao i fluorescentni protein neosjetljiv na GA. Pokazujemo da fuzije mutiranih RGA proteina ne ometaju endogenu GA signalizaciju kada su sveprisutno eksprimirane, te da ovaj biosenzor može kvantificirati signalnu aktivnost koja proizlazi i iz GA ulaza i iz obrade GA signala senzorskim aparatom s visokom prostorno-vremenskom rezolucijom. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje prostorno-vremenske raspodjele GA signalne aktivnosti i kvantificiranje načina na koji GA regulira stanično ponašanje u epidermi SAM-a. Pokazujemo da GA regulira orijentaciju ravnine diobe SAM stanica smještenih između primordija organa, čime definira kanonsku staničnu organizaciju internodija.
Konačno, pitali smo može li qmRGA prijaviti promjene u razinama endogenog GA korištenjem rastućih hipokotila. Prethodno smo pokazali da nitrat stimulira rast povećanjem sinteze GA i, posljedično, razgradnje PE34. Sukladno tome, primijetili smo da je duljina hipokotila u sadnicama pUBQ10::qmRGA uzgojenim pod obilnom opskrbom nitratom (10 mM NO3−) bila značajno duža nego u sadnicama uzgojenim u uvjetima nedostatka nitrata (Dodatna slika 6a). U skladu s odgovorom rasta, GA signali bili su viši u hipokotilima sadnica uzgojenih u uvjetima 10 mM NO3− nego u sadnicama uzgojenim u odsutnosti nitrata (Dodatna slika 6b, c). Dakle, qmRGA također omogućuje praćenje promjena u GA signalizaciji izazvanih endogenim promjenama u koncentraciji GA.
Kako bismo razumjeli ovisi li GA signalna aktivnost detektirana qmRGA o koncentraciji GA i percepciji GA, kako se očekivalo na temelju dizajna senzora, analizirali smo ekspresiju tri GID1 receptora u vegetativnim i reproduktivnim tkivima. U sadnicama je GID1-GUS reporterska linija pokazala da su GID1a i c visoko eksprimirani u kotiledonima (slika 3a–c). Osim toga, sva tri receptora su eksprimirana u listovima, bočnim korijenskim primordijima, vrhovima korijena (osim korijenove kapice GID1b) i vaskularnom sustavu (slika 3a–c). U cvatu SAM detektirali smo GUS signale samo za GID1b i 1c (dodatna slika 7a–c). In situ hibridizacija potvrdila je ove obrasce ekspresije i dodatno pokazala da je GID1c jednoliko eksprimiran na niskim razinama u SAM-u, dok je GID1b pokazao veću ekspresiju na periferiji SAM-a (dodatna slika 7d–l). Translacijska fuzija pGID1b::2xmTQ2-GID1b također je otkrila stupnjevani raspon ekspresije GID1b, od niske ili nikakve ekspresije u središtu SAM-a do visoke ekspresije na granicama organa (Dopunska slika 7m). Dakle, GID1 receptori nisu jednoliko raspoređeni po tkivima i unutar njih. U kasnijim eksperimentima također smo primijetili da prekomjerna ekspresija GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) povećava osjetljivost qmRGA u hipokotilima na vanjsku primjenu GA (Slika 3d, e). Nasuprot tome, fluorescencija izmjerena pomoću qd17mRGA u hipokotilu bila je neosjetljiva na tretman s GA3 (Slika 3f, g). Za oba testa, sadnice su tretirane visokim koncentracijama GA (100 μM GA3) kako bi se procijenilo brzo ponašanje senzora, gdje je sposobnost vezanja na GID1 receptor bila pojačana ili izgubljena. Zajedno, ovi rezultati potvrđuju da qmRGA biosenzor služi kombiniranoj funkciji kao GA i GA senzor, te sugeriraju da diferencijalna ekspresija GID1 receptora može značajno modulirati emisivnost senzora.
Do danas, distribucija GA signala u SAM-u ostaje nejasna. Stoga smo koristili biljke koje eksprimiraju qmRGA i pCLV3::mCherry-NLS reporter matičnih stanica35 za izračun kvantitativnih mapa visoke rezolucije GA signalne aktivnosti, fokusirajući se na L1 sloj (epidermis; slika 4a, b, vidi Metode i Dopunske metode), budući da L1 igra ključnu ulogu u kontroli rasta SAM-a36. Ovdje je ekspresija pCLV3::mCherry-NLS pružila fiksnu geometrijsku referentnu točku za analizu prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti37. Iako se GA smatra bitnim za razvoj lateralnih organa4, primijetili smo da su GA signali bili niski u cvjetnom primordiju (P) počevši od stadija P3 (slika 4a, b), dok su mladi P1 i P2 primordiji imali umjerenu aktivnost sličnu onoj u središnjem području (slika 4a, b). Veća GA signalna aktivnost otkrivena je na granicama primordija organa, počevši od P1/P2 (na stranama granice) i dostižući vrhunac na P4, kao i u svim stanicama periferne regije smještene između primordija (slika 4a, b i dodatna slika 8a, b). Ova veća GA signalna aktivnost uočena je ne samo u epidermi već i u L2 i gornjim L3 slojevima (dodatna slika 8b). Uzorak GA signala otkrivenih u SAM-u pomoću qmRGA također je ostao nepromijenjen tijekom vremena (dodatna slika 8c–f, k). Iako je konstrukt qd17mRGA sustavno smanjen u SAM-u T3 biljaka iz pet neovisnih linija koje smo detaljno okarakterizirali, uspjeli smo analizirati fluorescentne uzorke dobivene konstruktom pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (dodatna slika 8g–j, l). U ovoj kontrolnoj liniji otkrivene su samo manje promjene u omjeru fluorescencije u SAM-u, ali u središtu SAM-a uočili smo jasno i neočekivano smanjenje VENUS-a povezanog s TagBFP-om. To potvrđuje da signalni obrazac koji je uočila qmRGA odražava GA-ovisnu degradaciju mRGA-VENUS, ali također pokazuje da qmRGA može precijeniti GA signalnu aktivnost u središtu meristema. Ukratko, naši rezultati otkrivaju GA signalni obrazac koji prvenstveno odražava raspodjelu primordija. Ova raspodjela inter-primordijalne regije (IPR) posljedica je postupnog uspostavljanja visoke GA signalne aktivnosti između primordija u razvoju i središnje regije, dok se istovremeno GA signalna aktivnost u primordiju smanjuje (slika 4c, d).
Raspodjela GID1b i GID1c receptora (vidi gore) sugerira da diferencijalna ekspresija GA receptora pomaže u oblikovanju obrasca aktivnosti GA signala u SAM-u. Pitali smo se je li možda uključena diferencijalna akumulacija GA. Kako bismo istražili ovu mogućnost, koristili smo nlsGPS1 GA FRET senzor21. Povećana frekvencija aktivacije otkrivena je u SAM-u nlsGPS1 tretiranog s 10 μM GA4+7 tijekom 100 minuta (dodatna slika 9a-e), što ukazuje da nlsGPS1 reagira na promjene koncentracije GA u SAM-u, kao što to čini u korijenju21. Prostorna raspodjela frekvencije aktivacije nlsGPS1 otkrila je relativno niske razine GA u vanjskim slojevima SAM-a, ali je pokazala da su povišene u središtu i na rubovima SAM-a (slika 4e i dodatna slika 9a,c). To sugerira da je GA također raspoređen u SAM-u s prostornim uzorkom usporedivim s onim koji je otkrio qmRGA. Kao komplementarni pristup, SAM smo također tretirali fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ili samim Fl kao negativnom kontrolom. Fl signal je bio raspoređen po cijelom SAM-u, uključujući središnje područje i primordij, iako nižim intenzitetom (slika 4j i dodatna slika 10d). Nasuprot tome, sva tri GA-Fl su se akumulirala specifično unutar granica primordija i u različitim stupnjevima u ostatku IPR-a, s GA7-Fl koji se akumulirao u najvećoj domeni u IPR-u (slika 4k i dodatna slika 10a,b). Kvantifikacija intenziteta fluorescencije otkrila je da je omjer intenziteta IPR-a i ne-IPR-a bio veći u SAM-u tretiranom GA-Fl u usporedbi sa SAM-om tretiranim Fl-om (slika 4l i dodatna slika 10c). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je GA prisutan u većim koncentracijama u IPR stanicama koje se nalaze najbliže granici organa. To sugerira da obrazac aktivnosti SAM GA signala proizlazi i iz diferencijalne ekspresije GA receptora i diferencijalne akumulacije GA u IPR stanicama blizu granica organa. Dakle, naša analiza otkrila je neočekivani prostorno-vremenski obrazac GA signalizacije, s nižom aktivnošću u središtu i primordiju SAM-a i višom aktivnošću u IPR-u u perifernoj regiji.
Kako bismo razumjeli ulogu diferencijalne GA signalne aktivnosti u SAM-u, analizirali smo korelaciju između GA signalne aktivnosti, širenja stanica i diobe stanica korištenjem snimanja u stvarnom vremenu s vremenskim prekidom SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. S obzirom na ulogu GA u regulaciji rasta, očekivala se pozitivna korelacija s parametrima širenja stanica. Stoga smo prvo usporedili karte GA signalne aktivnosti s kartama brzine rasta stanične površine (kao zamjenu za snagu širenja stanica za danu stanicu i za stanice kćeri pri diobi) i s kartama anizotropije rasta, koja mjeri usmjerenost širenja stanica (također se ovdje koristi za danu stanicu i za stanice kćeri pri diobi; slika 5a,b, vidi Metode i Dopunske metode). Naše karte brzine rasta stanične površine SAM-a u skladu su s prethodnim opažanjima38,39, s minimalnim stopama rasta na granici i maksimalnim stopama rasta u cvjetovima u razvoju (slika 5a). Analiza glavnih komponenti (PCA) pokazala je da je GA signalna aktivnost negativno korelirana s intenzitetom rasta stanične površine (slika 5c). Također smo pokazali da su glavne osi varijacije, uključujući ulaz GA signalizacije i intenzitet rasta, ortogonalne na smjer određen visokom ekspresijom CLV3, što potvrđuje isključenje stanica iz SAM centra u preostalim analizama. Spearmanova korelacijska analiza potvrdila je rezultate PCA (Slika 5d), što ukazuje na to da viši GA signali u IPR-u nisu rezultirali većom ekspanzijom stanica. Međutim, korelacijska analiza otkrila je blagu pozitivnu korelaciju između aktivnosti GA signalizacije i anizotropije rasta (Slika 5c, d), što sugerira da viša GA signalizacija u IPR-u utječe na smjer rasta stanica i moguće položaj ravnine diobe stanica.
a, b Toplinske karte srednjeg površinskog rasta (a) i anizotropije rasta (b) u SAM-u usrednjene za sedam neovisnih biljaka (korištene kao zamjene za snagu i smjer širenja stanica). c PCA analiza uključivala je sljedeće varijable: GA signal, intenzitet površinskog rasta, anizotropiju površinskog rasta i ekspresiju CLV3. PCA komponenta 1 bila je uglavnom negativno korelirana s intenzitetom površinskog rasta i pozitivno korelirala s GA signalom. PCA komponenta 2 bila je uglavnom pozitivno korelirana s anizotropijom površinskog rasta i negativno korelirala s ekspresijom CLV3. Postoci predstavljaju varijaciju objašnjenu svakom komponentom. d Spearmanova korelacijska analiza između GA signala, intenziteta površinskog rasta i anizotropije površinskog rasta na razini tkiva isključujući CZ. Broj s desne strane je Spearmanova rho vrijednost između dvije varijable. Zvjezdice označavaju slučajeve u kojima je korelacija/negativna korelacija vrlo značajna. e 3D vizualizacija Col-0 SAM L1 stanica konfokalnom mikroskopijom. Nove stanične stijenke formirane u SAM-u (ali ne i primordiju) nakon 10 sati obojene su prema njihovim kutnim vrijednostima. Traka boja prikazana je u donjem desnom kutu. Umetak prikazuje odgovarajuću 3D sliku u 0 h. Pokus je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. f Okvirni dijagrami prikazuju brzine diobe stanica u IPR i ne-IPR Col-0 SAM-u (n = 10 neovisnih biljaka). Središnja linija prikazuje medijan, a granice okvira označavaju 25. i 75. percentil. Brkovi označavaju minimalne i maksimalne vrijednosti određene R softverom. P vrijednosti dobivene su Welchovim dvostranim t-testom. g, h Shematski dijagram koji prikazuje (g) kako izmjeriti kut nove stanične stijenke (magenta) u odnosu na radijalni smjer od središta SAM-a (bijela isprekidana linija) (uzimaju se u obzir samo vrijednosti oštrog kuta, tj. 0–90°), i (h) obodni/lateralni i radijalni smjer unutar meristema. i Histogrami frekvencija orijentacije ravnine diobe stanica preko SAM-a (tamnoplava), IPR-a (srednje plava) i ne-IPR-a (svijetloplava). P-vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. j Frekvencijski histogrami orijentacije ravnine diobe stanica IPR-a oko P3 (svijetlozelena), P4 (srednje zelena) i P5 (tamnozelena). P-vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima.
Stoga smo zatim istražili korelaciju između GA signalizacije i aktivnosti stanične diobe identificiranjem novostvorenih staničnih stijenki tijekom testa (slika 5e). Ovaj pristup nam je omogućio mjerenje učestalosti i smjera stanične diobe. Iznenađujuće, otkrili smo da je učestalost staničnih dioba u IPR-u i ostatku SAM-a (ne-IPR, slika 5f) bila slična, što ukazuje na to da razlike u GA signalizaciji između IPR i ne-IPR stanica ne utječu značajno na diobu stanica. To, i pozitivna korelacija između GA signalizacije i anizotropije rasta, potaknula nas je da razmotrimo može li aktivnost GA signalizacije utjecati na orijentaciju ravnine stanične diobe. Izmjerili smo orijentaciju nove stanične stijenke kao oštar kut u odnosu na radijalnu os koja spaja središte meristema i središte nove stanične stijenke (slika 5e-i) i uočili jasnu tendenciju diobe stanica pod kutovima bliskim 90° u odnosu na radijalnu os, s najvišim frekvencijama uočenim na 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (slika 5e,i), što odgovara staničnim diobama u obodnom/poprečnom smjeru (slika 5h). Kako bismo ispitali doprinos GA signalizacije ovom ponašanju stanične diobe, analizirali smo parametre stanične diobe u IPR-u i ne-IPR-u zasebno (slika 5i). Uočili smo da se raspodjela kuta diobe u IPR stanicama razlikuje od one u stanicama bez IPR-a ili u stanicama cijelog SAM-a, pri čemu IPR stanice pokazuju veći udio lateralnih/kružnih staničnih dioba, tj. 70–80° i 80–90° (33,86% odnosno 30,71%, odgovarajući omjeri) (slika 5i). Dakle, naša su opažanja otkrila povezanost između visoke GA signalizacije i orijentacije ravnine diobe stanica blizu obodnog smjera, slično korelaciji između aktivnosti GA signalizacije i anizotropije rasta (slika 5c, d). Kako bismo dodatno utvrdili prostornu očuvanost ove povezanosti, izmjerili smo orijentaciju ravnine diobe u IPR stanicama koje okružuju primordij počevši od P3, budući da je najveća aktivnost GA signalizacije otkrivena u ovoj regiji počevši od P4 (slika 4). Kutovi diobe IPR-a oko P3 i P4 nisu pokazali statistički značajne razlike, iako je uočena povećana učestalost lateralnih staničnih dioba u IPR-u oko P4 (slika 5j). Međutim, u IPR stanicama oko P5, razlika u orijentaciji ravnine stanične diobe postala je statistički značajna, s naglim porastom učestalosti transverzalnih staničnih dioba (slika 5j). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GA signalizacija može kontrolirati orijentaciju staničnih dioba u SAM-u, što je u skladu s prethodnim izvješćima40,41 da visoka GA signalizacija može izazvati lateralnu orijentaciju staničnih dioba u IPR-u.
Predviđa se da stanice u IPR-u neće biti ugrađene u primordije, već u internodije2,42,43. Transverzalna orijentacija staničnih dioba u IPR-u može rezultirati tipičnom organizacijom paralelnih uzdužnih redova epidermalnih stanica u internodijima. Naša gore opisana zapažanja sugeriraju da GA signalizacija vjerojatno igra ulogu u ovom procesu reguliranjem smjera stanične diobe.
Gubitak funkcije nekoliko gena DNA rezultira konstitutivnim GA odgovorom, a della mutanti mogu se koristiti za testiranje ove hipoteze44. Prvo smo analizirali obrasce ekspresije pet gena DNA u SAM-u. Transkripcijska fuzija GUS linije45 otkrila je da su GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (u mnogo manjoj mjeri) eksprimirani u SAM-u (Dopunska slika 11a-d). In situ hibridizacija dodatno je pokazala da se GAI mRNA akumulira specifično u primordijima i cvjetovima u razvoju (Dopunska slika 11e). RGL1 i RGL3 mRNA otkrivene su u cijelom krošnji SAM-a i u starijim cvjetovima, dok je RGL2 mRNA bila obilnija u graničnom području (Dopunska slika 11f-h). Konfokalno snimanje pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo je ekspresiju uočenu in situ hibridizacijom i pokazalo da se RGL3 protein akumulira u središnjem dijelu SAM-a (Dopunska slika 11i). Koristeći liniju pRGA::GFP-RGA, također smo otkrili da se RGA protein akumulira u SAM-u, ali njegova količina se smanjuje na granici počevši od P4 (dodatna slika 11j). Značajno je da su obrasci ekspresije RGL3 i RGA u skladu s većom aktivnošću GA signalizacije u IPR-u, što je detektirano pomoću qmRGA (slika 4). Štoviše, ovi podaci ukazuju na to da su svi DNA proteini eksprimirani u SAM-u i da njihova ekspresija kolektivno obuhvaća cijeli SAM.
Zatim smo analizirali parametre stanične diobe u divljem tipu SAM-a (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globalnim) mutantima (slika 6a, b). Zanimljivo je da smo uočili statistički značajan pomak u raspodjeli frekvencija kutova stanične diobe u della global mutantu SAM u usporedbi s divljim tipom (slika 6c). Ova promjena u della global mutantu bila je posljedica povećanja učestalosti kutova od 80–90° (34,71% u odnosu na 24,55%) i, u manjoj mjeri, kutova od 70–80° (23,78% u odnosu na 20,18%), tj. odgovara poprečnim staničnim diobama (slika 6c). Učestalost ne-poprečnih dioba (0–60°) također je bila niža u della global mutantu (slika 6c). Učestalost poprečnih staničnih dioba značajno je povećana u SAM-u della global mutanta (slika 6b). Učestalost transverzalnih staničnih dioba u IPR-u također je bila veća kod della global mutanta u usporedbi s divljim tipom (slika 6d). Izvan IPR regije, divlji tip je imao ujednačeniju raspodjelu kutova stanične diobe, dok je della global mutant preferirao tangencijalne diobe poput IPR-a (slika 6e). Također smo kvantificirali orijentaciju staničnih dioba u SAM-u petostrukih mutanata ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), GA-neaktivne mutantne pozadine u kojoj se GA akumulira. U skladu s povećanjem razina GA, SAM peterostrukog ga2ox mutanta cvata bio je veći od onog kod Col-0 (dodatna slika 12a, b), a u usporedbi s Col-0, peterostruki ga2ox SAM pokazao je izrazito drugačiju raspodjelu kutova stanične diobe, s frekvencijom kuta koja se povećavala od 50° do 90°, tj. ponovno u korist tangencijalnih dioba (dodatna slika 12a–c). Dakle, pokazujemo da konstitutivna aktivacija GA signalizacije i akumulacija GA induciraju lateralne stanične diobe u IPR-u i ostatku SAM-a.
a, b 3D vizualizacija L1 sloja PI-obojenog Ler (a) i globalnog della mutanta (b) SAM-a pomoću konfokalne mikroskopije. Prikazane su nove stanične stijenke formirane u SAM-u (ali ne i primordiju) tijekom razdoblja od 10 sati i obojene prema njihovim vrijednostima kuta. Umetak prikazuje SAM u 0 sati. Traka boja prikazana je u donjem desnom kutu. Strelica u (b) pokazuje na primjer poravnanih staničnih datoteka u globalnom della mutantu. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. ce usporedba frekvencijske raspodjele orijentacija ravnina stanične diobe u cijelom SAM-u (d), IPR (e) i ne-IPR (f) između Ler i globalnog della. P vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slika PI-obojenog SAM-a transgenih biljaka Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Ploče (a, b) prikazuju nove stanične stijenke (ali ne i primordije) formirane u SAM-u unutar 10 sati. Pokus je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. h–j Usporedba frekvencijske raspodjele orijentacija ravnina stanične diobe smještenih u cijelom SAM-u (h), IPR-u (i) i ne-IPR-u (j) između biljaka Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. P-vrijednosti dobivene su dvostranim Kolmogorov-Smirnovljevim testom.
Zatim smo testirali učinak inhibicije GA signalizacije specifično u IPR-u. U tu svrhu koristili smo promotor kotiledonske čašice 2 (CUC2) kako bismo potaknuli ekspresiju dominantno negativnog gai-1 proteina spojenog s VENUS-om (u liniji pCUC2::gai-1-VENUS). U divljem tipu SAM-a, CUC2 promotor pokreće ekspresiju većine IPR-ova u SAM-u, uključujući granične stanice, od P4 nadalje, a slična specifična ekspresija uočena je u biljkama pCUC2::gai-1-VENUS (vidi dolje). Raspodjela kutova stanične diobe preko SAM-a ili IPR-a biljaka pCUC2::gai-1-VENUS nije se značajno razlikovala od one kod divljeg tipa, iako smo neočekivano otkrili da se stanice bez IPR-a u tim biljkama dijele većom učestalošću od 80–90° (slika 6f–j).
Sugerirano je da smjer diobe stanica ovisi o geometriji SAM-a, posebno o vlačnom naprezanju generiranom zakrivljenošću tkiva46. Stoga smo se pitali je li oblik SAM-a promijenjen kod biljaka della global mutanta i pCUC2::gai-1-VENUS. Kao što je prethodno objavljeno12, veličina della global mutanta SAM-a bila je veća od one divljeg tipa (dodatna slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 i STM RNA potvrdila je širenje meristema kod della mutanata i nadalje pokazala lateralno širenje niše matičnih stanica (dodatna slika 13e, f, h, i). Međutim, zakrivljenost SAM-a bila je slična u oba genotipa (dodatna slika 13k, m, n, p). Uočili smo slično povećanje veličine kod gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della četverostrukog mutanta bez promjene zakrivljenosti u usporedbi s divljim tipom (dodatna slika 13c, d, g, j, l, o, p). Učestalost orijentacije staničnih dioba također je bila pogođena kod della quadruple mutanta, ali u manjoj mjeri nego kod della monolitnog mutanta (Dopunska slika 12d-f). Ovaj učinak doze, zajedno s nedostatkom učinka na zakrivljenost, sugerira da rezidualna RGL3 aktivnost kod Della quadruple mutanta ograničava promjene u orijentaciji staničnih dioba uzrokovane gubitkom aktivnosti DNA i da se promjene u lateralnim staničnim diobama javljaju kao odgovor na promjene u aktivnosti GA signalizacije, a ne na promjene u geometriji SAM-a. Kao što je gore opisano, CUC2 promotor pokreće ekspresiju IPR u SAM-u počevši od P4 (Dopunska slika 14a, b), a nasuprot tome, pCUC2::gai-1-VENUS SAM imao je smanjenu veličinu, ali veću zakrivljenost (Dopunska slika 14c-h). Ova promjena u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM može rezultirati drugačijom raspodjelom mehaničkih naprezanja u usporedbi s divljim tipom, kod kojeg visoka obodna naprezanja počinju na kraćoj udaljenosti od središta SAM-a47. Alternativno, promjene u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM mogu biti rezultat promjena u regionalnim mehaničkim svojstvima izazvanih ekspresijom transgena48. U oba slučaja, to bi moglo djelomično nadoknaditi učinke promjena u GA signalizaciji povećanjem vjerojatnosti da će se stanice dijeliti u kružnoj/transverzalnoj orijentaciji, što objašnjava naša zapažanja.
Uzeti zajedno, naši podaci potvrđuju da viša GA signalizacija igra aktivnu ulogu u lateralnoj orijentaciji ravnine stanične diobe u IPR-u. Također pokazuju da zakrivljenost meristema također utječe na orijentaciju ravnine stanične diobe u IPR-u.
Transverzalna orijentacija ravnine diobe u IPR-u, zbog visoke aktivnosti GA signalizacije, sugerira da GA prethodno organizira radijalni stanični file u epidermi unutar SAM-a kako bi definirao staničnu organizaciju koja će se kasnije naći u epidermalnom internodiju. Doista, takvi stanični fileovi često su bili vidljivi na SAM slikama della global mutanata (slika 6b). Stoga, kako bismo dalje istražili razvojnu funkciju prostornog obrasca GA signalizacije u SAM-u, koristili smo snimanje s ubrzanim prekidom kako bismo analizirali prostornu organizaciju stanica u IPR-u kod transgenih biljaka divljeg tipa (Ler i Col-0), della global mutanata i pCUC2::gai-1-VENUS.
Otkrili smo da qmRGA pokazuje da se aktivnost GA signala u IPR-u povećava od P1/P2 i dostiže vrhunac na P4, te da je taj obrazac ostao konstantan tijekom vremena (slika 4a–f i dodatna slika 8c–f, k). Kako bismo analizirali prostornu organizaciju stanica u IPR-u s povećanjem GA signala, označili smo Ler IPR stanice iznad i sa strane P4 prema njihovoj razvojnoj sudbini analiziranoj 34 sata nakon prvog promatranja, tj. više od dva plastidna vremena, što nam je omogućilo praćenje IPR stanica tijekom razvoja primordija od P1/P2 do P4. Koristili smo tri različite boje: žutu za one stanice koje su bile integrirane u primordij blizu P4, zelenu za one koje su bile u IPR-u i ljubičastu za one koje su sudjelovale u oba procesa (slika 7a–c). U t0 (0 h), 1–2 sloja IPR stanica bila su vidljiva ispred P4 (slika 7a). Kao što se i očekivalo, kada su se ove stanice dijelile, to su činile uglavnom putem transverzalne ravnine diobe (slike 7a–c). Slični rezultati dobiveni su korištenjem Col-0 SAM-a (s fokusom na P3, čiji se rub savija slično kao P4 kod Ler-a), iako je kod ovog genotipa nabor nastao na cvjetnom rubu brže sakrio IPR stanice (slika 7g–i). Dakle, obrazac diobe IPR stanica prethodno organizira stanice u radijalne redove, kao u internodijima. Organizacija radijalnih redova i lokalizacija IPR stanica između uzastopnih organa sugeriraju da su te stanice internodalni progenitori.
Ovdje smo razvili raciometrijski GA signalni biosenzor, qmRGA, koji omogućuje kvantitativno mapiranje GA signalne aktivnosti koja proizlazi iz kombiniranih koncentracija GA i GA receptora, a istovremeno minimizira interferenciju s endogenim signalnim putovima, čime se pružaju informacije o GA funkciji na staničnoj razini. U tu svrhu konstruirali smo modificirani PELL protein, mRGA, koji je izgubio sposobnost vezanja PELL interakcijskih partnera, ali ostaje osjetljiv na GA-induciranu proteolizu. qmRGA reagira i na egzogene i na endogene promjene u razinama GA, a njegova dinamička svojstva osjećanja omogućuju procjenu prostorno-vremenskih promjena u GA signalnoj aktivnosti tijekom razvoja. qmRGA je također vrlo fleksibilan alat jer se može prilagoditi različitim tkivima promjenom promotora koji se koristi za njegovu ekspresiju (ako je potrebno), a s obzirom na konzerviranu prirodu GA signalnog puta i PFYRE motiva među kritosjemenjačama, vjerojatno je da će se moći prenijeti na druge vrste22. U skladu s tim, pokazano je da ekvivalentna mutacija u rižinom SLR1 DNA proteinu (HYY497AAA) također suzbija aktivnost represora rasta SLR1, dok samo neznatno smanjuje njegovu GA-posredovanu razgradnju, slično mRGA23. Značajno je da su nedavne studije na Arabidopsisu pokazale da je jedna mutacija aminokiseline u PFYRE domeni (S474L) promijenila transkripcijsku aktivnost RGA bez utjecaja na njegovu sposobnost interakcije s partnerskim transkripcijskim faktorima50. Iako je ova mutacija vrlo blizu 3 supstitucije aminokiselina prisutne u mRGA, naše studije pokazuju da ove dvije mutacije mijenjaju različite karakteristike DNA. Iako se većina partnera transkripcijskih faktora veže za LHR1 i SAW domene DNA26,51, neke konzervirane aminokiseline u PFYRE domeni mogu pomoći u stabilizaciji tih interakcija.
Razvoj internodija ključna je značajka u biljnoj arhitekturi i poboljšanju prinosa. qmRGA je otkrio veću GA signalnu aktivnost u IPR internodijskim progenitorskim stanicama. Kombiniranjem kvantitativnog snimanja i genetike, pokazali smo da GA signalni obrasci superponiraju kružne/transverzalne ravnine stanične diobe u epidermi SAM-a, oblikujući organizaciju stanične diobe potrebnu za razvoj internodija. Tijekom razvoja identificirano je nekoliko regulatora orijentacije ravnine stanične diobe52,53. Naš rad pruža jasan primjer kako GA signalna aktivnost regulira ovaj stanični parametar. može stupiti u interakciju s kompleksima proteina prije savijanja41, tako da GA signalizacija može regulirati orijentaciju ravnine stanične diobe izravnim utjecajem na orijentaciju kortikalnih mikrotubula40,41,54,55. Neočekivano smo pokazali da u SAM-u korelat veće GA signalne aktivnosti nije izduživanje ili dioba stanica, već samo anizotropija rasta, što je u skladu s izravnim učinkom GA na smjer stanične diobe u IPR-u. Međutim, ne možemo isključiti da bi ovaj učinak mogao biti i neizravan, na primjer posredovan GA-induciranim omekšavanjem stanične stijenke56. Promjene u svojstvima stanične stijenke izazivaju mehanički stres57,58, koji također može utjecati na orijentaciju ravnine stanične diobe utječući na orijentaciju kortikalnih mikrotubula39,46,59. Kombinirani učinci mehaničkog stresa izazvanog GA i izravne regulacije orijentacije mikrotubula pomoću GA mogu biti uključeni u stvaranje specifičnog obrasca orijentacije stanične diobe u IPR-u kako bi se definirali internodiji, a potrebna su daljnja istraživanja kako bi se testirala ova ideja. Slično tome, prethodne studije istaknule su važnost proteina TCP14 i 15 koji interagiraju s DNA u kontroli stvaranja internodija60,61, a ovi čimbenici mogu posredovati djelovanje GA zajedno s BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), koji reguliraju razvoj internodija i za koje je pokazano da utječu na GA signalizaciju2,62. S obzirom na to da Aleksandrijev hormon interagira sa signalnim putovima brasinosteroida, etilena, jasmonske kiseline i abscisinske kiseline (ABA)63,64 te da ti hormoni mogu utjecati na orijentaciju mikrotubula65, učinci GA na orijentaciju stanične diobe mogu biti posredovani i drugim hormonima.
Rane citološke studije pokazale su da su i unutarnja i vanjska područja Arabidopsis SAM-a potrebni za razvoj internodija2,42. Činjenica da GA aktivno regulira diobu stanica u unutarnjim tkivima12 podržava dvostruku funkciju GA u regulaciji veličine meristema i internodija u SAM-u. Uzorak usmjerene diobe stanica također je strogo reguliran u unutarnjem tkivu SAM-a, a ta je regulacija bitna za rast stabljike52. Bit će zanimljivo ispitati igra li GA također ulogu u orijentaciji ravnine diobe stanica u unutarnjoj organizaciji SAM-a, čime se sinkronizira specifikacija i razvoj internodija unutar SAM-a.
Biljke su uzgajane in vitro u tlu ili 1x Murashige-Skoog (MS) mediju (Duchefa) nadopunjenom s 1% saharoze i 1% agara (Sigma) pod standardnim uvjetima (16 h svjetla, 22 °C), osim za eksperimente s hipokotilom i rastom korijena u kojima su sadnice uzgajane na vertikalnim pločama pod konstantnim svjetlom i 22 °C. Za eksperimente s nitratima, biljke su uzgajane na modificiranom MS mediju (bioWORLD biljni medij) nadopunjenom s odgovarajućom količinom nitrata (0 ili 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1% saharoze i 1% A-agara (Sigma) pod uvjetima dugog dana.
GID1a cDNA umetnuta u pDONR221 rekombinirana je s pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry u pB7m34GW kako bi se generirao pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA umetnuta u pDONR221 rekombinirana je u pB7RWG266 kako bi se generirao p35S:IDD2-RFP. Za generiranje pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragment od 3,9 kb uzvodno od kodirajuće regije GID1b i fragment od 4,7 kb koji sadrži cDNA GID1b (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) prvo su amplificirani korištenjem primera u Dodatnoj tablici 3, a zatim umetnuti u pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivno, te konačno rekombinirani s pDONR221 2xmTQ268 u ciljni vektor pGreen 012567 korištenjem Gateway kloniranja. Za generiranje pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotorska sekvenca (3229 bp uzvodno od ATG) nakon čega slijedi kodirajuća sekvenca velikog Stokes-pomaknutog mOrange (LSSmOrange)69 s N7 signalom nuklearne lokalizacije i NOS transkripcijskim terminatorom sastavljeni su u pGreen vektor za ciljanje kanamicina pomoću Gateway 3-fragment rekombinacijskog sustava (Invitrogen). Biljni binarni vektor uveden je u soj Agrobacterium tumefaciens GV3101 i u listove Nicotiana benthamiana metodom infiltracije Agrobacterium te u Arabidopsis thaliana Col-0 metodom umaka u cvjetne stijenke. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA izolirani su iz F3 i F1 potomstva odgovarajućih križanja.
RNA in situ hibridizacija provedena je na vrhovima izdanaka duljine približno 1 cm72, koji su prikupljeni i odmah fiksirani u otopini FAA (3,7% formaldehida, 5% octene kiseline, 50% etanola) prethodno ohlađenoj na 4 °C. Nakon 2 × 15 min vakuumskih tretmana, fiksativ je promijenjen i uzorci su inkubirani preko noći. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 cDNA i antisense probe za njihove 3'-UTR sintetizirane su korištenjem primera prikazanih u Dodatnoj tablici 3 kako je opisano od strane Rosiera i suradnika.73 Digoksigeninom obilježene sonde imunodetektiran su pomoću digoksigenin antitijela (3000-struko razrjeđenje; Roche, kataloški broj: 11 093 274 910), a rezovi su obojeni otopinom 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfata (BCIP, 250-struko razrjeđenje)/nitroplavog tetrazolija (NBT, 200-struko razrjeđenje).
Vrijeme objave: 10. veljače 2025.