DELLA proteini su konzerviraniregulatori rastakoji igraju središnju ulogu u razvoju biljaka kao odgovor na unutarnje i vanjske signale. Kao regulatori transkripcije, DELLA se vežu na transkripcijske faktore (TF) i histon H2A preko svojih GRAS domena i regrutiraju se da djeluju na promotore. Nedavne studije su pokazale da je stabilnost DELLA regulirana post-translacijski putem dva mehanizma: poliubikvitinacija inducirana biljnim hormonomgiberelin, što dovodi do njihove brze razgradnje i konjugacije s malim modifikatorom sličnim ubikvitinu (SUMO), što povećava njihovu akumulaciju. Štoviše, aktivnost DELLA je dinamički regulirana pomoću dva različita mehanizma glikozilacije: O-fukozilacija pojačava DELLA-TF interakciju, dok O-povezana modifikacija N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) inhibira DELLA-TF interakciju. Međutim, uloga fosforilacije DELLA je nejasna jer su prethodne studije pokazale proturječne rezultate, pri čemu neke sugeriraju da fosforilacija potiče ili potiskuje razgradnju DELLA, a druge sugeriraju da fosforilacija ne utječe na njihovu stabilnost. Ovdje identificiramo fosforilacijska mjesta u GA1-3 represoru (RGA), AtDELLA, pročišćenom iz Arabidopsis thaliana masenom spektrometrijom i pokazujemo da fosforilacija dvaju RGA peptida u regijama PolyS i PolyS/T pojačava aktivnost RGA promicanjem vezanja H2A i povezanosti RGA s ciljnim promotorima. Značajno, fosforilacija nije utjecala na RGA-TF interakcije ili RGA stabilnost. Naša studija otkriva molekularni mehanizam kojim fosforilacija inducira aktivnost DELLA.
Naša spektrometrijska analiza mase otkrila je da su i Pep1 i Pep2 visoko fosforilirani u RGA u Ga1 pozadini s manjkom GA. Uz ovu studiju, fosfoproteomske studije također su otkrile Pep1 fosforilaciju u RGA, iako njena uloga još nije proučena53,54,55. Nasuprot tome, Pep2 fosforilacija nije prethodno opisana budući da se ovaj peptid može detektirati samo korištenjem RGAGKG transgena. Iako je mutacija m1A, koja je ukinula fosforilaciju Pep1, samo neznatno smanjila aktivnost RGA u biljkama, imala je aditivni učinak u kombinaciji s m2A u smanjenju aktivnosti RGA (dodatna slika 6). Važno je da je Pep1 fosforilacija značajno smanjena u GA-pojačanom sly1 mutantu u usporedbi s ga1, što sugerira da GA potiče RGA defosforilaciju, smanjujući njegovu aktivnost. Mehanizam kojim GA potiskuje fosforilaciju RGA zahtijeva daljnje istraživanje. Jedna je mogućnost da se to postiže regulacijom neidentificirane protein kinaze. Iako su studije pokazale da je ekspresija CK1 protein kinaze EL1 smanjena pomoću GA u riži41, naši rezultati pokazuju da mutacije višeg reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne smanjuju fosforilaciju RGA. U skladu s našim rezultatima, nedavna fosfoproteomska studija koja je koristila linije Arabidopsis AEL s prekomjernom ekspresijom i ael trostruki mutant nije identificirala nikakve DELLA proteine kao supstrate ovih kinaza56. Kada smo pripremili rukopis, objavljeno je da GSK3, gen koji kodira GSK3/SHAGGY-sličnu kinazu u pšenici (Triticum aestivum), može fosforilirati DELLA (Rht-B1b)57, iako fosforilacija Rht-B1b pomoću GSK3 nije potvrđena u biljkama. In vitro enzimske reakcije u prisutnosti GSK3 praćene analizom masene spektrometrije otkrile su tri mjesta fosforilacije smještena između DELLA i GRAS domena Rht-B1b (dodatna slika 3). Supstitucije serina u alanin na sva tri mjesta fosforilacije dovele su do smanjene aktivnosti Rht-B1b u transgenoj pšenici, u skladu s našim nalazima da su supstitucije alanina u Pep2 RGA smanjile aktivnost RGA. Međutim, testovi razgradnje proteina in vitro dodatno su pokazali da fosforilacija također može stabilizirati Rht-B1b57. To je u suprotnosti s našim rezultatima koji pokazuju da supstitucije alanina u Pep2 RGA ne mijenjaju njegovu stabilnost u biljkama. GSK3 u pšenici je ortolog proteina 2 (BIN2) neosjetljivog na brasinosteroide u Arabidopsisu 57. BIN2 je negativni regulator BR signalizacije, a BR aktivira svoj signalni put uzrokujući degradaciju BIN2 58. Pokazali smo da tretman BR-om ne smanjuje stabilnost RGA 59 ili razine fosforilacije u Arabidopsisu (dopunska slika 2), što sugerira da je malo vjerojatno da će RGA biti fosforiliran pomoću BIN2.
Svi kvantitativni podaci statistički su obrađeni u Excelu, a značajne razlike utvrđene su Studentovim t-testom. Nisu korištene statističke metode za prethodno određivanje veličine uzorka. Nijedan podatak nije isključen iz analize; eksperiment nije bio randomiziran; a istraživači su bili svjesni raspodjele tijekom eksperimenta i procjene ishoda. Veličine uzoraka navedene su u legendama slika i u datotekama s neobrađenim podacima.
Vrijeme objave: 15. travnja 2025