DELLA proteini su konzerviraniregulatori rastakoji igraju središnju ulogu u razvoju biljaka kao odgovor na unutarnje i vanjske signale. Kao transkripcijski regulatori, Aleksandrijev protein (DALL) veže se na transkripcijske faktore (TF) i histon H2A putem svojih GRAS domena te se regrutiraju za djelovanje na promotore. Nedavne studije pokazale su da je Aleksandrina stabilnost posttranslacijsko regulirana dvama mehanizmima: poliubikvitinacijom induciranom biljnim hormonomgiberelin, što dovodi do njihove brze razgradnje, i konjugacije s malim ubikvitinu sličnim modifikatorom (SUMO), što povećava njihovo nakupljanje. Štoviše, aktivnost CYP3A4 dinamički je regulirana s dva različita mehanizma glikozilacije: O-fukozilacija pojačava interakciju CYP3A4 i CYP3A4, dok modifikacija CYP3A4 vezanog N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) inhibira interakciju CYP3A4. Međutim, uloga CYP3A4 fosforilacije nije jasna jer su prethodne studije pokazale oprečne rezultate, pri čemu neke sugeriraju da fosforilacija potiče ili potiskuje razgradnju CYP3A4, a druge sugeriraju da fosforilacija ne utječe na njihovu stabilnost. Ovdje identificiramo mjesta fosforilacije u GA1-3 represoru (RGA), AtDELLA, pročišćenom iz Arabidopsis thaliana masenom spektrometrijom i pokazujemo da fosforilacija dva RGA peptida u PolyS i PolyS/T regijama pojačava aktivnost CYP3A4 promovirajući vezanje H2A i povezivanje CYP3A4 s ciljnim promotorima. Značajno je da fosforilacija nije utjecala na interakcije CYP3A4 i CYP3A4 ili stabilnost CYP3A4. Naša studija otkriva molekularni mehanizam kojim fosforilacija inducira CYP3A4 aktivnost.
Naša analiza masenom spektrometrijom otkrila je da su i Pep1 i Pep2 bili visoko fosforilirani u RGA u GA-deficitarnoj Ga1 pozadini. Uz ovu studiju, fosfoproteomske studije također su otkrile fosforilaciju Pep1 u RGA, iako njezina uloga još nije proučena53,54,55. Nasuprot tome, fosforilacija Pep2 nije prethodno opisana jer se ovaj peptid mogao detektirati samo pomoću RGAGKG transgena. Iako je mutacija m1A, koja je ukinula fosforilaciju Pep1, samo neznatno smanjila aktivnost RGA u biljkama, imala je aditivni učinak u kombinaciji s m2A u smanjenju aktivnosti RGA (Dodatna slika 6). Važno je da je fosforilacija Pep1 bila značajno smanjena u GA-pojačanom sly1 mutantu u usporedbi s ga1, što sugerira da GA potiče defosforilaciju RGA, smanjujući njegovu aktivnost. Mehanizam kojim GA potiskuje fosforilaciju RGA zahtijeva daljnja istraživanja. Jedna mogućnost je da se to postiže regulacijom neidentificirane protein kinaze. Iako su studije pokazale da je ekspresija CK1 proteinske kinaze EL1 smanjena pomoću GA u riži41, naši rezultati pokazuju da mutacije višeg reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne smanjuju fosforilaciju RGA. U skladu s našim rezultatima, nedavna fosfoproteomska studija korištenjem linija Arabidopsis koje prekomjerno eksprimiraju AEL i trostrukog mutanta ael nije identificirala nijedan DNA protein kao supstrat ovih kinaza56. Kada smo pripremali rukopis, objavljeno je da GSK3, gen koji kodira kinazu sličnu GSK3/SHAGGY u pšenici (Triticum aestivum), može fosforilirati DNA (Rht-B1b)57, iako fosforilacija Rht-B1b pomoću GSK3 nije potvrđena in planta. In vitro enzimske reakcije u prisutnosti GSK3, nakon čega slijedi analiza masenom spektrometrijom, otkrile su tri mjesta fosforilacije smještena između Domains of the Domains of the Domains of the General Algonations (Dodatna slika 3). Supstitucije serina alaninom na sva tri mjesta fosforilacije rezultirale su smanjenom aktivnošću Rht-B1b u transgeničnoj pšenici, što je u skladu s našim nalazima da supstitucije alanina u Pep2 RGA smanjile aktivnost RGA. Međutim, in vitro testovi razgradnje proteina dodatno su pokazali da fosforilacija također može stabilizirati Rht-B1b57. To je u suprotnosti s našim rezultatima koji pokazuju da supstitucije alanina u Pep2 RGA ne mijenjaju njegovu stabilnost in planta. GSK3 u pšenici je ortolog proteina 2 neosjetljivog na brassinosteroide (BIN2) u Arabidopsis 57. BIN2 je negativni regulator BR signalizacije, a BR aktivira njegov signalni put uzrokujući razgradnju BIN2 58. Pokazali smo da tretman BR ne smanjuje stabilnost RGA 59 ili razinu fosforilacije u Arabidopsis (Dodatna slika 2), što sugerira da je malo vjerojatno da će BIN2 fosforilirati RGA.
Svi kvantitativni podaci statistički su analizirani pomoću Excela, a značajne razlike utvrđene su Studentovim t-testom. Nisu korištene statističke metode za prethodno određivanje veličine uzorka. Nijedan podatak nije isključen iz analize; eksperiment nije bio randomiziran; a istraživači su bili svjesni raspodjele tijekom eksperimenta i procjene ishoda. Veličine uzoraka navedene su u legendama slika i u datotekama s neobrađenim podacima.
Vrijeme objave: 15. travnja 2025.