Ova studija procijenila je letalnost, subletalnost i toksičnost komercijalnihcipermetrinformulacije na punoglavce bezolovca. U akutnom testu testirane su koncentracije od 100–800 μg/L tijekom 96 sati. U kroničnom testu testirane su prirodno prisutne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 i 20 μg/L) na smrtnost, nakon čega je uslijedilo testiranje mikronukleusa i abnormalnosti jezgre eritrocita tijekom 7 dana. LC50 komercijalne formulacije cipermetrina na punoglavce bio je 273,41 μg L−1. U kroničnom testu, najviša koncentracija (20 μg L−1) rezultirala je smrtnošću većom od 50%, jer je ubila polovicu testiranih punoglavaca. Mikronukleusni test pokazao je značajne rezultate pri 6 i 20 μg L−1 i otkriveno je nekoliko abnormalnosti jezgre, što ukazuje na to da komercijalna formulacija cipermetrina ima genotoksični potencijal protiv P. gracilis. Cipermetrin predstavlja visok rizik za ovu vrstu, što ukazuje na to da može uzrokovati višestruke probleme i utjecati na dinamiku ovog ekosustava kratkoročno i dugoročno. Stoga se može zaključiti da komercijalne formulacije cipermetrina imaju toksične učinke na P. gracilis.
Zbog kontinuiranog širenja poljoprivrednih aktivnosti i intenzivne primjenesuzbijanje štetočinamjere, vodene životinje često su izložene pesticidima1,2. Onečišćenje vodnih resursa u blizini poljoprivrednih polja može utjecati na razvoj i preživljavanje organizama koji nisu ciljna skupina, poput vodozemaca.
Vodozemci postaju sve važniji u procjeni matrica okoliša. Bezvodne životinje smatraju se dobrim bioindikatorima onečišćujućih tvari u okolišu zbog svojih jedinstvenih karakteristika kao što su složeni životni ciklusi, brze stope rasta ličinki, trofički status, propusna koža10,11, ovisnost o vodi za reprodukciju12 i nezaštićena jaja11,13,14. Mala vodena žaba (Physalaemus gracilis), poznata kao plačuća žaba, pokazala se kao bioindikatorska vrsta onečišćenja pesticidima4,5,6,7,15. Vrsta se nalazi u stajaćim vodama, zaštićenim područjima ili područjima s promjenjivim staništem u Argentini, Urugvaju, Paragvaju i Brazilu1617 i smatra se stabilnom prema IUCN klasifikaciji zbog svoje široke rasprostranjenosti i tolerancije na različita staništa18.
Subletalni učinci zabilježeni su kod vodozemaca nakon izlaganja cipermetrinu, uključujući promjene u ponašanju, morfologiju i biokemiju punoglavaca23,24,25, promijenjenu smrtnost i vrijeme metamorfoze, enzimske promjene, smanjen uspjeh izleganja24,25, hiperaktivnost26, inhibiciju aktivnosti kolinesteraze27 i promjene u performansama plivanja7,28. Međutim, studije genotoksičnih učinaka cipermetrina kod vodozemaca su ograničene. Stoga je važno procijeniti osjetljivost bezglavih vrsta na cipermetrin.
Zagađenje okoliša utječe na normalan rast i razvoj vodozemaca, ali najozbiljniji štetni učinak je genetsko oštećenje DNK uzrokovano izloženošću pesticidima13. Analiza morfologije krvnih stanica važan je bioindikator onečišćenja i potencijalne toksičnosti tvari za divlje vrste29. Mikronukleusni test jedna je od najčešće korištenih metoda za određivanje genotoksičnosti kemikalija u okolišu30. To je brza, učinkovita i jeftina metoda koja je dobar pokazatelj kemijskog onečišćenja organizama poput vodozemaca31,32 i može pružiti informacije o izloženosti genotoksičnim zagađivačima33.
Cilj ove studije bio je procijeniti toksični potencijal komercijalnih formulacija cipermetrina za male vodene punoglavce korištenjem mikronukleusnog testa i procjene ekološkog rizika.
Kumulativna smrtnost (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tijekom akutnog razdoblja ispitivanja.
Kumulativni mortalitet (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tijekom kroničnog testa.
Uočena visoka smrtnost bila je rezultat genotoksičnih učinaka kod vodozemaca izloženih različitim koncentracijama cipermetrina (6 i 20 μg/L), što dokazuje prisutnost mikronukleusa (MN) i nuklearnih abnormalnosti u eritrocitima. Stvaranje MN ukazuje na pogreške u mitozi i povezano je sa slabim vezanjem kromosoma za mikrotubule, defektima u proteinskim kompleksima odgovornim za unos i transport kromosoma, pogreškama u segregaciji kromosoma i pogreškama u popravku oštećenja DNK38,39 te može biti povezano s oksidativnim stresom izazvanim pesticidima40,41. Druge abnormalnosti uočene su pri svim procijenjenim koncentracijama. Povećanje koncentracija cipermetrina povećalo je nuklearne abnormalnosti u eritrocitima za 5% odnosno 20% pri najnižim (1 μg/L) i najvišim (20 μg/L) dozama. Na primjer, promjene u DNK vrste mogu imati ozbiljne posljedice za kratkoročno i dugoročno preživljavanje, što rezultira padom populacije, promijenjenom reproduktivnom sposobnošću, križanjem u srodstvu, gubitkom genetske raznolikosti i promijenjenim stopama migracije. Svi ovi čimbenici mogu utjecati na preživljavanje i održavanje vrste42,43. Nastanak eritroidnih abnormalnosti može ukazivati na blokadu citokineze, što rezultira abnormalnom diobom stanica (dvojedrni eritrociti)44,45; višerežnjevite jezgre su izbočine nuklearne membrane s više režnjeva46, dok druge eritroidne abnormalnosti mogu biti povezane s amplifikacijom DNA, poput nuklearnih bubrega/mjehurića47. Prisutnost eritrocita bez jezgre može ukazivati na poremećen transport kisika, posebno u kontaminiranoj vodi48,49. Apoptoza ukazuje na staničnu smrt50.
Druge studije su također pokazale genotoksične učinke cipermetrina. Kabaña i sur.51 pokazali su prisutnost mikronukleusa i promjena jezgre poput binuklearnih stanica i apoptotičkih stanica u stanicama Odontophrynus americanus nakon izlaganja visokim koncentracijama cipermetrina (5000 i 10 000 μg L−1) tijekom 96 sati. Apoptoza izazvana cipermetrinom također je otkrivena kod P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Ovi rezultati sugeriraju da cipermetrin ima genotoksične učinke na niz vodenih organizama te da MN i ENA test može biti pokazatelj subletalnih učinaka na vodozemce te da se može primijeniti na domaće vrste i divlje populacije izložene toksinima12.
Komercijalne formulacije cipermetrina predstavljaju visoku opasnost za okoliš (i akutnu i kroničnu), s HQ-ovima koji prelaze razinu Agencije za zaštitu okoliša SAD-a (EPA)54, što može negativno utjecati na vrstu ako je prisutno u okolišu. U procjeni kroničnog rizika, NOEC za smrtnost bio je 3 μg L−1, što potvrđuje da koncentracije pronađene u vodi mogu predstavljati rizik za vrstu55. Letalni NOEC za ličinke R. arenarum izložene smjesi endosulfana i cipermetrina bio je 500 μg L−1 nakon 168 sati; ta se vrijednost smanjila na 0,0005 μg L−1 nakon 336 sati. Autori pokazuju da što je dulja izloženost, to su niže koncentracije štetne za vrstu. Također je važno istaknuti da su vrijednosti NOEC-a bile veće od onih kod P. gracilis pri istom vremenu izloženosti, što ukazuje na to da je odgovor vrste na cipermetrin specifičan za vrstu. Nadalje, što se tiče smrtnosti, CHQ vrijednost P. gracilis nakon izlaganja cipermetrinu dosegla je 64,67, što je više od referentne vrijednosti koju je postavila Agencija za zaštitu okoliša SAD-a54, a CHQ vrijednost ličinki R. arenarum također je bila viša od ove vrijednosti (CHQ > 388,00 nakon 336 sati), što ukazuje na to da proučavani insekticidi predstavljaju visok rizik za nekoliko vrsta vodozemaca. S obzirom na to da P. gracilis treba približno 30 dana za dovršetak metamorfoze56, može se zaključiti da proučavane koncentracije cipermetrina mogu doprinijeti smanjenju populacije sprječavanjem zaraženih jedinki da uđu u odraslu ili reproduktivnu fazu u ranoj dobi.
U izračunatoj procjeni rizika mikronukleusa i drugih abnormalnosti jezgre eritrocita, vrijednosti CHQ-a kretale su se od 14,92 do 97,00, što ukazuje na to da cipermetrin ima potencijalni genotoksični rizik za P. gracilis čak i u njegovom prirodnom staništu. Uzimajući u obzir smrtnost, maksimalna koncentracija ksenobiotičkih spojeva podnošljiva za P. gracilis bila je 4,24 μg L−1. Međutim, koncentracije niske do 1 μg/L također su pokazale genotoksične učinke. Ta činjenica može dovesti do povećanja broja abnormalnih jedinki57 i utjecati na razvoj i reprodukciju vrsta u njihovim staništima, što dovodi do smanjenja populacija vodozemaca.
Komercijalne formulacije insekticida cipermetrina pokazale su visoku akutnu i kroničnu toksičnost za P. gracilis. Uočene su veće stope smrtnosti, vjerojatno zbog toksičnih učinaka, što dokazuje prisutnost mikronukleusa i abnormalnosti jezgre eritrocita, posebno nazubljenih jezgri, režnjevastih jezgri i vezikularnih jezgri. Osim toga, proučavane vrste pokazale su povećane rizike za okoliš, i akutne i kronične. Ovi podaci, u kombinaciji s prethodnim studijama naše istraživačke skupine, pokazali su da čak i različite komercijalne formulacije cipermetrina i dalje uzrokuju smanjenu aktivnost acetilkolinesteraze (AChE) i butirilkolinesteraze (BChE) te oksidativni stres58, te rezultiraju promjenama u aktivnosti plivanja i oralnim malformacijama59 kod P. gracilis, što ukazuje na to da komercijalne formulacije cipermetrina imaju visoku letalnu i subletalnu toksičnost za ovu vrstu. Hartmann i sur.60 otkrili su da su komercijalne formulacije cipermetrina bile najtoksičnije za P. gracilis i drugu vrstu istog roda (P. cuvieri) u usporedbi s devet drugih pesticida. To sugerira da zakonski odobrene koncentracije cipermetrina za zaštitu okoliša mogu rezultirati visokom smrtnošću i dugoročnim padom populacije.
Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se procijenila toksičnost pesticida za vodozemce, budući da koncentracije pronađene u okolišu mogu uzrokovati visoku smrtnost i predstavljati potencijalni rizik za P. gracilis. Treba poticati istraživanja vrsta vodozemaca jer su podaci o tim organizmima oskudni, posebno o brazilskim vrstama.
Test kronične toksičnosti trajao je 168 sati (7 dana) pod statičkim uvjetima, a subletalne koncentracije bile su: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. U oba eksperimenta, 10 punoglavaca po tretiranoj skupini procijenjeno je sa šest ponavljanja, za ukupno 60 punoglavaca po koncentraciji. U međuvremenu, tretman samo s vodom služio je kao negativna kontrola. Svaka eksperimentalna postavka sastojala se od sterilne staklene posude kapaciteta 500 ml i gustoće od 1 punoglavca na 50 ml otopine. Tikvica je bila prekrivena polietilenskom folijom kako bi se spriječilo isparavanje i kontinuirano se prozračivala.
Voda je kemijski analizirana kako bi se odredile koncentracije pesticida u 0, 96 i 168 sati. Prema Sabinu i sur. 68 te Martinsu i sur. 69, analize su provedene u Laboratoriju za analizu pesticida (LARP) Federalnog sveučilišta Santa Maria korištenjem plinske kromatografije povezane s trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometrijom (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Kvantitativno određivanje pesticida u vodi prikazano je kao dodatni materijal (Tablica SM1).
Za mikronukleusni test (MNT) i test nuklearnih abnormalnosti eritrocita (RNA), analizirano je 15 punoglavaca iz svake tretirane skupine. Punoglavci su anestezirani s 5% lidokainom (50 mg g-170), a uzorci krvi prikupljeni su srčanom punkcijom pomoću jednokratnih hepariniziranih šprica. Razmazi krvi pripremljeni su na sterilnim mikroskopskim pločicama, osušeni na zraku, fiksirani sa 100% metanolom (4 °C) tijekom 2 minute, a zatim obojeni 10% Giemsa otopinom tijekom 15 minuta u mraku. Na kraju postupka, pločice su isprane destiliranom vodom kako bi se uklonio višak boje i osušene na sobnoj temperaturi.
Najmanje 1000 eritrocita iz svakog punoglavca analizirano je pomoću mikroskopa od 100× s objektivom od 71 kako bi se utvrdila prisutnost MN i ENA. Ukupno 75 796 eritrocita iz punoglavaca procijenjeno je uzimajući u obzir koncentracije cipermetrina i kontrole. Genotoksičnost je analizirana prema metodi Carrasca i sur. te Fenecha i sur.38,72 određivanjem učestalosti sljedećih nuklearnih lezija: (1) anuklearne stanice: stanice bez jezgre; (2) apoptotičke stanice: fragmentacija jezgre, programirana stanična smrt; (3) binuklearne stanice: stanice s dvije jezgre; (4) nuklearni pupoljci ili mjehurićaste stanice: stanice s jezgrama s malim izbočinama nuklearne membrane, mjehurići slične veličine mikrojezgrama; (5) kariolizirane stanice: stanice samo s obrisom jezgre bez unutarnjeg materijala; (6) zarezane stanice: stanice s jezgrama s očitim pukotinama ili zarezima u obliku, koje se nazivaju i jezgre u obliku bubrega; (7) režnjaste stanice: stanice s nuklearnim izbočinama većim od prethodno spomenutih vezikula; i (8) mikrostanice: stanice s kondenziranim jezgrama i smanjenom citoplazmom. Promjene su uspoređene s rezultatima negativne kontrole.
Rezultati testa akutne toksičnosti (LC50) analizirani su pomoću GBasic softvera i TSK-Trimmed Spearman-Karber metode74. Podaci kroničnog testa prethodno su testirani na normalnost pogreške (Shapiro-Wilks) i homogenost varijance (Bartlett). Rezultati su analizirani jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Tukeyjev test korišten je za usporedbu podataka među sobom, a Dunnettov test za usporedbu podataka između tretirane skupine i negativne kontrolne skupine.
Podaci LOEC i NOEC analizirani su Dunnettovim testom. Statistički testovi provedeni su pomoću Statistica 8.0 softvera (StatSoft) s razinom značajnosti od 95% (p < 0,05).
Vrijeme objave: 13. ožujka 2025.