Ova studija procijenila je smrtnost, subletalnost i toksičnost komercijalnih proizvodacipermetrinformulacije za anuran punoglavce. U akutnom testu, koncentracije od 100-800 μg/L testirane su tijekom 96 sati. U kroničnom testu, prirodne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 i 20 μg/L) testirane su na smrtnost, nakon čega je uslijedilo testiranje mikronukleusa i abnormalnosti jezgre crvenih krvnih stanica tijekom 7 dana. LC50 komercijalne formulacije cipermetrina za punoglavce bio je 273,41 μg L-1. U kroničnom testu, najviša koncentracija (20 μg L-1) rezultirala je smrtnošću većom od 50%, jer je ubila polovicu testiranih punoglavaca. Mikronukleusni test pokazao je značajne rezultate pri 6 i 20 μg L−1 i otkriveno je nekoliko nuklearnih abnormalnosti, što ukazuje da komercijalna formulacija cipermetrina ima genotoksični potencijal protiv P. gracilis. Cipermetrin predstavlja visok rizik za ovu vrstu, što ukazuje na to da može uzrokovati višestruke probleme i utjecati na dinamiku ovog ekosustava kratkoročno i dugoročno. Stoga se može zaključiti da komercijalne formulacije cipermetrina imaju toksične učinke na P. gracilis.
Zbog kontinuiranog širenja poljoprivrednih aktivnosti i intenzivne primjenekontrola štetočinamjere, vodene životinje često su izložene pesticidima1,2. Onečišćenje vodnih resursa u blizini poljoprivrednih polja može utjecati na razvoj i preživljavanje organizama koji nisu ciljna skupina, poput vodozemaca.
Vodozemci postaju sve važniji u procjeni ekoloških matrica. Anurani se smatraju dobrim bioindikatorima zagađivača okoliša zbog svojih jedinstvenih karakteristika kao što su složeni životni ciklusi, brze stope rasta ličinki, trofički status, propusna koža10,11, ovisnost o vodi za reprodukciju12 i nezaštićena jaja11,13,14. Mala vodena žaba (Physalaemus gracilis), poznata kao plakajuća žaba, pokazala se kao bioindikatorska vrsta onečišćenja pesticidima4,5,6,7,15. Vrsta se nalazi u stajaćim vodama, zaštićenim područjima ili područjima s promjenjivim staništima u Argentini, Urugvaju, Paragvaju i Brazilu1617 i smatra se stabilnom prema klasifikaciji IUCN-a zbog široke rasprostranjenosti i tolerancije na različita staništa18.
Zabilježeni su subletalni učinci kod vodozemaca nakon izlaganja cipermetrinu, uključujući promjene u ponašanju, morfološke i biokemijske promjene u punoglavaca23,24,25, promijenjenu smrtnost i vrijeme metamorfoze, enzimske promjene, smanjen uspjeh izlijeganja24,25, hiperaktivnost26, inhibiciju aktivnosti kolinesteraze27 i promjene u performansama plivanja7,28. Međutim, istraživanja genotoksičnih učinaka cipermetrina kod vodozemaca su ograničena. Stoga je važno procijeniti osjetljivost vrsta anurana na cipermetrin.
Onečišćenje okoliša utječe na normalan rast i razvoj vodozemaca, ali najozbiljniji štetni učinak je genetsko oštećenje DNK uzrokovano izloženošću pesticidima13. Analiza morfologije krvnih stanica važan je bioindikator onečišćenja i potencijalne toksičnosti tvari za divlje vrste29. Mikronukleus test jedna je od najčešće korištenih metoda za određivanje genotoksičnosti kemikalija u okolišu30. To je brza, učinkovita i jeftina metoda koja je dobar pokazatelj kemijskog onečišćenja organizama kao što su vodozemci31,32 i može pružiti informacije o izloženosti genotoksičnim zagađivačima33.
Cilj ove studije bio je procijeniti toksični potencijal komercijalnih formulacija cipermetrina za male vodene punoglavce koristeći mikronukleus test i procjenu ekološkog rizika.
Kumulativna smrtnost (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tijekom akutnog razdoblja testa.
Kumulativna smrtnost (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tijekom kroničnog testa.
Uočena visoka smrtnost rezultat je genotoksičnih učinaka u vodozemaca izloženih različitim koncentracijama cipermetrina (6 i 20 µg/L), što je dokazano prisutnošću mikronukleusa (MN) i nuklearnih abnormalnosti u eritrocitima. Stvaranje MN ukazuje na pogreške u mitozi i povezano je sa slabim vezanjem kromosoma na mikrotubule, defektima u proteinskim kompleksima odgovornim za unos i transport kromosoma, pogreškama u segregaciji kromosoma i pogreškama u popravku oštećenja DNK38,39 i može biti povezano s oksidativnim stresom izazvanim pesticidima40,41. Druge abnormalnosti uočene su u svim procijenjenim koncentracijama. Povećanje koncentracije cipermetrina povećalo je nuklearne abnormalnosti u eritrocitima za 5% odnosno 20% pri najnižoj (1 μg/L) odnosno najvišoj (20 μg/L) dozi. Na primjer, promjene u DNK vrste mogu imati ozbiljne posljedice za kratkoročno i dugoročno preživljavanje, što rezultira smanjenjem populacije, promijenjenom reproduktivnom sposobnošću, srodstvom, gubitkom genetske raznolikosti i promijenjenom stopom migracije. Svi ti čimbenici mogu utjecati na preživljavanje i održavanje vrste42,43. Stvaranje eritroidnih abnormalnosti može ukazivati na blokadu citokineze, što rezultira abnormalnom staničnom diobom (binukleirani eritrociti)44,45; multilobed jezgre su izbočine nuklearne membrane s više režnjeva46, dok druge eritroidne abnormalnosti mogu biti povezane s amplificiranjem DNA, kao što su jezgri bubrezi/mjehurići47. Prisutnost eritrocita bez jezgre može ukazivati na oslabljen transport kisika, osobito u kontaminiranoj vodi48,49. Apoptoza ukazuje na staničnu smrt50.
Druge studije također su pokazale genotoksične učinke cipermetrina. Kabaña et al.51 pokazali su prisutnost mikronukleusa i nuklearnih promjena kao što su binuklearne stanice i apoptotične stanice u stanicama Odontophrynus americanus nakon izlaganja visokim koncentracijama cipermetrina (5000 i 10 000 μg L-1) tijekom 96 sati. Apoptoza izazvana cipermetrinom također je otkrivena u P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Ovi rezultati sugeriraju da cipermetrin ima genotoksične učinke na niz vodenih organizama i da MN i ENA test mogu biti pokazatelj subletalnih učinaka na vodozemce i mogu se primijeniti na domaće vrste i divlje populacije izložene toksikantima12.
Komercijalne formulacije cipermetrina predstavljaju visoku opasnost za okoliš (i akutnu i kroničnu), sa sjedištem koje premašuje razinu Agencije za zaštitu okoliša SAD-a (EPA)54 koja može negativno utjecati na vrstu ako je prisutna u okolišu. U procjeni kroničnog rizika, NOEC za smrtnost bio je 3 μg L−1, potvrđujući da koncentracije pronađene u vodi mogu predstavljati rizik za vrstu55. Smrtonosni NOEC za ličinke bakterije R. arenarum izložene mješavini endosulfana i cipermetrina bio je 500 μg L-1 nakon 168 h; ova se vrijednost smanjila na 0,0005 μg L−1 nakon 336 h. Autori pokazuju da što je dulja izloženost, to su niže koncentracije koje su štetne za vrstu. Također je važno naglasiti da su NOEC vrijednosti bile veće od onih za P. gracilis u istom vremenu izlaganja, što ukazuje da je odgovor vrste na cipermetrin specifičan za vrstu. Nadalje, što se tiče mortaliteta, CHQ vrijednost P. gracilis nakon izlaganja cipermetrinu dosegla je 64,67, što je više od referentne vrijednosti koju je postavila Agencija za zaštitu okoliša SAD-a54, a CHQ vrijednost ličinki R. arenarum također je bila viša od te vrijednosti (CHQ > 388,00 nakon 336 h), što ukazuje da ispitivani insekticidi predstavljaju veliki rizik za nekoliko vrste vodozemaca. Uzimajući u obzir da je P. gracilis potrebno približno 30 dana za dovršetak metamorfoze56, može se zaključiti da proučavane koncentracije cipermetrina mogu pridonijeti padu populacije sprječavajući zaražene jedinke da u ranoj dobi uđu u odraslu ili reproduktivnu fazu.
U izračunatoj procjeni rizika od mikronukleusa i drugih nuklearnih abnormalnosti eritrocita, vrijednosti CHQ kretale su se od 14,92 do 97,00, što ukazuje da je cipermetrin imao potencijalni genotoksični rizik za P. gracilis čak i u svom prirodnom staništu. Uzimajući u obzir mortalitet, maksimalna koncentracija ksenobiotičkih spojeva koju je P. gracilis tolerirala iznosila je 4,24 μg L−1. Međutim, koncentracije niže od 1 μg/L također su pokazale genotoksične učinke. Ova činjenica može dovesti do povećanja broja abnormalnih jedinki57 i utjecati na razvoj i reprodukciju vrsta u njihovim staništima, što dovodi do smanjenja populacije vodozemaca.
Komercijalne formulacije insekticida cipermetrina pokazale su visoku akutnu i kroničnu toksičnost za P. gracilis. Uočene su veće stope smrtnosti, vjerojatno zbog toksičnih učinaka, što je dokazano prisutnošću mikronukleusa i nuklearnih abnormalnosti eritrocita, posebno nazubljenih jezgri, režnjevitih jezgri i vezikularnih jezgri. Osim toga, proučavane vrste pokazale su povećane rizike za okoliš, akutne i kronične. Ovi podaci, u kombinaciji s prethodnim studijama naše istraživačke skupine, pokazali su da čak i različite komercijalne formulacije cipermetrina još uvijek uzrokuju smanjene aktivnosti acetilkolinesteraze (AChE) i butirilkolinesteraze (BChE) i oksidativni stres58, te rezultiraju promjenama u plivačkoj aktivnosti i oralnim malformacijama59 kod P. gracilis, što ukazuje da komercijalne formulacije cipermetrina imaju visoku smrtonosnu i subletalnu toksičnost za ovu vrste. Hartmann i sur. 60 otkrili su da su komercijalne formulacije cipermetrina bile najotrovnije za P. gracilis i drugu vrstu istog roda (P. cuvieri) u usporedbi s devet drugih pesticida. To sugerira da zakonski odobrene koncentracije cipermetrina za zaštitu okoliša mogu rezultirati visokom smrtnošću i dugoročnim smanjenjem populacije.
Potrebne su daljnje studije kako bi se procijenila toksičnost pesticida za vodozemce, budući da koncentracije nađene u okolišu mogu uzrokovati visoku smrtnost i predstavljati potencijalni rizik za P. gracilis. Trebalo bi poticati istraživanje vrsta vodozemaca jer su podaci o tim organizmima rijetki, osobito o brazilskim vrstama.
Ispitivanje kronične toksičnosti trajalo je 168 h (7 dana) u statičkim uvjetima, a subletalne koncentracije bile su: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. U oba eksperimenta, 10 punoglavaca po tretiranoj skupini procijenjeno je sa šest ponavljanja, za ukupno 60 punoglavaca po koncentraciji. U međuvremenu, tretman samo vodom služio je kao negativna kontrola. Svaki eksperimentalni postav sastojao se od sterilne staklene posude kapaciteta 500 ml i gustoće 1 punoglavca na 50 ml otopine. Tikvica je prekrivena polietilenskom folijom kako bi se spriječilo isparavanje i kontinuirano prozračivana.
Voda je kemijski analizirana kako bi se odredile koncentracije pesticida na 0, 96 i 168 sati. Prema Sabinu i sur. 68 i Martins et al. 69, analize su provedene u Laboratoriju za analizu pesticida (LARP) Federalnog sveučilišta Santa Maria korištenjem plinske kromatografije spojene s trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometrijom (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Kvantitativno određivanje pesticida u vodi prikazano je kao dodatni materijal (Tablica SM1).
Za test mikronukleusa (MNT) i test nuklearnih abnormalnosti crvenih stanica (RNA), analizirano je 15 punoglavaca iz svake tretirane skupine. Punoglavci su anestezirani s 5% lidokainom (50 mg g-170) i uzorci krvi su sakupljeni kardijalnom punkcijom pomoću jednokratnih hepariniziranih štrcaljki. Razmazi krvi pripremljeni su na sterilnim stakalcima mikroskopa, osušeni na zraku, fiksirani 100% metanolom (4 °C) 2 minute, a zatim obojeni 10% otopinom Giemse 15 minuta u mraku. Na kraju procesa stakalca su isprana destiliranom vodom kako bi se uklonio višak mrlje i osušena na sobnoj temperaturi.
Najmanje 1000 crvenih krvnih zrnaca iz svakog punoglavca analizirano je pomoću 100x mikroskopa sa 71 objektivom kako bi se odredila prisutnost MN i ENA. Procijenjeno je ukupno 75 796 eritrocita iz punoglavaca s obzirom na koncentracije cipermetrina i kontrole. Genotoksičnost je analizirana prema metodi Carrasco i sur. i Fenech et al.38,72 određivanjem učestalosti sljedećih nuklearnih lezija: (1) stanice bez jezgre: stanice bez jezgre; (2) apoptotičke stanice: fragmentacija jezgre, programirana stanična smrt; (3) dvojezgrene stanice: stanice s dvije jezgre; (4) jezgri pupoljci ili mjehuriće stanice: stanice s jezgrama s malim izbočinama jezgrene membrane, mjehurići slične veličine mikronukleusima; (5) kariolizirane stanice: stanice samo s obrisom jezgre bez unutarnjeg materijala; (6) stanice s urezima: stanice s jezgrama s očitim pukotinama ili urezima u obliku, koje se nazivaju i jezgre u obliku bubrega; (7) lobulirane stanice: stanice s nuklearnim izbočinama većim od gore spomenutih vezikula; i (8) mikrostanice: stanice sa kondenziranom jezgrom i smanjenom citoplazmom. Promjene su uspoređivane s rezultatima negativne kontrole.
Rezultati ispitivanja akutne toksičnosti (LC50) analizirani su korištenjem GBasic softvera i TSK-Trimmed Spearman-Karber metode74. Podaci kroničnog testa prethodno su testirani na normalnost pogreške (Shapiro-Wilks) i homogenost varijance (Bartlett). Rezultati su analizirani jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Tukeyev test korišten je za međusobnu usporedbu podataka, a Dunnettov test za usporedbu podataka između liječene skupine i negativne kontrolne skupine.
LOEC i NOEC podaci analizirani su Dunnettovim testom. Statistički testovi provedeni su programom Statistica 8.0 (StatSoft) s razinom značajnosti od 95% (p < 0,05).
Vrijeme objave: 13. ožujka 2025