Sezonska raspodjela oborina u provinciji Guizhou je neravnomjerna, s više oborina u proljeće i ljeto, ali sadnice uljane repice osjetljive su na stres od suše u jesen i zimu, što ozbiljno utječe na prinos. Gorušica je posebna uljarica koja se uglavnom uzgaja u provinciji Guizhou. Ima snažnu otpornost na sušu i može se uzgajati u planinskim područjima. Bogat je resurs gena otpornih na sušu. Otkriće gena otpornih na sušu od ključne je važnosti za poboljšanje sorti gorušice i inovacije u resursima germplazme. Obitelj GRF igra ključnu ulogu u rastu i razvoju biljaka te odgovoru na stres od suše. Trenutno su GRF geni pronađeni u Arabidopsis 2, riži (Oryza sativa) 12, uljanoj repici 13, pamuku (Gossypium hirsutum) 14, pšenici (Triticum aestivum) 15, bisernom prosu (Setaria italica) 16 i Brassica 17, ali nema izvješća o GRF genima otkrivenim u gorušici. U ovoj studiji, geni obitelji GRF gorušice identificirani su na razini cijelog genoma te su analizirane njihove fizičke i kemijske karakteristike, evolucijski odnosi, homologija, konzervirani motivi, struktura gena, duplikacije gena, cis-elementi i stadij sadnice (stadij četiri lista). Obrasci ekspresije pod stresom suše sveobuhvatno su analizirani kako bi se pružila znanstvena osnova za daljnja istraživanja o potencijalnoj funkciji BjGRF gena u odgovoru na sušu i kako bi se osigurali kandidatski geni za uzgoj gorušice otporne na sušu.
Trideset četiri BjGRF gena identificirana su u genomu Brassica juncea pomoću dva HMMER pretraživanja, a svi sadrže QLQ i WRC domene. CDS sekvence identificiranih BjGRF gena prikazane su u Dodatnoj tablici S1. BjGRF01–BjGRF34 nazvani su na temelju svog položaja na kromosomu. Fizikalno-kemijska svojstva ove porodice ukazuju na to da je duljina aminokiselina vrlo varijabilna, u rasponu od 261 aminokiseline (BjGRF19) do 905 aminokiselina (BjGRF28). Izoelektrična točka BjGRF kreće se od 6,19 (BjGRF02) do 9,35 (BjGRF03) s prosjekom od 8,33, a 88,24% BjGRF je bazični protein. Predviđeni raspon molekularne težine BjGRF je od 29,82 kDa (BjGRF19) do 102,90 kDa (BjGRF28); Indeks nestabilnosti BjGRF proteina kreće se od 51,13 (BjGRF08) do 78,24 (BjGRF19), svi su veći od 40, što ukazuje na to da se indeks masnih kiselina kreće od 43,65 (BjGRF01) do 78,78 (BjGRF22), prosječna hidrofilnost (GRAVY) kreće se od -1,07 (BjGRF31) do -0,45 (BjGRF22), svi hidrofilni BjGRF proteini imaju negativne GRAVY vrijednosti, što može biti posljedica nedostatka hidrofobnosti uzrokovane ostacima. Predviđanje subcelularne lokalizacije pokazalo je da se 31 protein kodiran BjGRF-om može lokalizirati u jezgri, BjGRF04 se može lokalizirati u peroksisomima, BjGRF25 se može lokalizirati u citoplazmi, a BjGRF28 se može lokalizirati u kloroplastima (Tablica 1), što ukazuje na to da bi BjGRF-ovi mogli biti lokalizirani u jezgri i igrati važnu regulatornu ulogu kao transkripcijski faktor.
Filogenetska analiza GRF porodica kod različitih vrsta može pomoći u proučavanju genskih funkcija. Stoga su preuzeti aminokiselinske sekvence pune duljine 35 GRF-ova uljane repice, 16 repe, 12 riže, 10 prosa i 9 Arabidopsis GRF-ova te je konstruirano filogenetsko stablo na temelju 34 identificirana BjGRF gena (slika 1). Tri podfamilije sadrže različit broj članova; 116 GRF TF-ova podijeljeno je u tri različite podfamilije (skupine A~C), koje sadrže 59 (50,86%), 34 (29,31%) i 23 (19,83)% GRF-ova. Među njima, 34 člana BjGRF porodice raspršeno je u 3 podfamilije: 13 članova u skupini A (38,24%), 12 članova u skupini B (35,29%) i 9 članova u skupini C (26,47%). U procesu poliploidizacije gorušice, broj BjGRF gena u različitim podfamilijama je različit, te je moguće da je došlo do amplifikacije i gubitka gena. Vrijedi napomenuti da u skupini C nema distribucije GRF-ova riže i prosa, dok u skupini B postoje 2 GRF-a riže i 1 GRF prosa, a većina GRF-ova riže i prosa grupirana je u jednoj grani, što ukazuje na to da su BjGRF-ovi usko povezani s dikotima. Među njima, najdetaljnije studije o funkciji GRF-a u Arabidopsis thaliana pružaju osnovu za funkcionalne studije BjGRF-ova.
Filogenetsko stablo gorušice uključujući Brassica napus, Brassica napus, rižu, proso i članove porodice Arabidopsis thaliana GRF.
Analiza repetitivnih gena u obitelji GRF gorušice. Siva linija u pozadini predstavlja sinkronizirani blok u genomu gorušice, crvena linija predstavlja par segmentiranih ponavljanja gena BjGRF;
Ekspresija gena BjGRF pod stresom suše u fazi četvrtog lista. Podaci qRT-PCR prikazani su u Dodatnoj tablici S5. Značajne razlike u podacima označene su malim slovima.
Kako se globalna klima nastavlja mijenjati, proučavanje načina na koji se usjevi nose sa stresom suše i poboljšanje njihovih mehanizama tolerancije postalo je vruća tema istraživanja18. Nakon suše, morfološka struktura, ekspresija gena i metabolički procesi biljaka će se promijeniti, što može dovesti do prestanka fotosinteze i metaboličkih poremećaja, utječući na prinos i kvalitetu usjeva19,20,21. Kada biljke osjete signale suše, proizvode sekundarne glasnike poput Ca2+ i fosfatidilinozitola, povećavaju unutarstaničnu koncentraciju kalcijevih iona i aktiviraju regulatornu mrežu puta fosforilacije proteina22,23. Konačni ciljni protein izravno je uključen u staničnu obranu ili regulira ekspresiju srodnih gena stresa putem transkripcijskih faktora (TF), povećavajući toleranciju biljaka na stres24,25. Dakle, TF-ovi igraju ključnu ulogu u odgovoru na stres od suše. Prema sekvenci i svojstvima vezanja DNA TF-ova koji reagiraju na stres od suše, TF-ovi se mogu podijeliti u različite porodice, kao što su GRF, ERF, MYB, WRKY i druge porodice26.
Obitelj gena GRF je vrsta biljno specifičnog faktora transkripcije koji igra važnu ulogu u raznim aspektima kao što su rast, razvoj, prijenos signala i obrambeni odgovori biljaka27. Otkad je prvi GRF gen identificiran u O. sativa28, sve više GRF gena identificirano je u mnogim vrstama i pokazalo se da utječu na rast, razvoj biljaka i odgovor na stres8, 29, 30,31,32. Objavljivanjem sekvence genoma Brassica juncea, identifikacija obitelji gena BjGRF postala je moguća33. U ovoj studiji identificirano je 34 BjGRF gena u cijelom genomu gorušice i nazvano BjGRF01–BjGRF34 na temelju njihovog kromosomskog položaja. Svi oni sadrže visoko konzervirane QLQ i WRC domene. Analiza fizikalno-kemijskih svojstava pokazala je da razlike u broju aminokiselina i molekularnim težinama BjGRF proteina (osim BjGRF28) nisu bile značajne, što ukazuje na to da članovi obitelji BjGRF mogu imati slične funkcije. Analiza genske strukture pokazala je da 64,7% BjGRF gena sadrži 4 eksona, što ukazuje na to da je struktura BjGRF gena relativno očuvana u evoluciji, ali je broj eksona u genima BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 i BjGRF29 veći. Studije su pokazale da dodavanje ili brisanje eksona ili introna može dovesti do razlika u strukturi i funkciji gena, čime se stvaraju novi geni34,35,36. Stoga nagađamo da je intron BjGRF izgubljen tijekom evolucije, što može uzrokovati promjene u funkciji gena. U skladu s postojećim studijama, također smo otkrili da je broj introna povezan s ekspresijom gena. Kada je broj introna u genu velik, gen može brzo reagirati na različite nepovoljne čimbenike.
Duplikacija gena glavni je čimbenik u genomskoj i genetskoj evoluciji37. Povezane studije pokazale su da duplikacija gena ne samo da povećava broj GRF gena, već služi i kao sredstvo za stvaranje novih gena koji pomažu biljkama da se prilagode raznim nepovoljnim uvjetima okoliša38. U ovoj studiji pronađeno je ukupno 48 dupliciranih parova gena, a sve su bile segmentalne duplikacije, što ukazuje na to da su segmentalne duplikacije glavni mehanizam za povećanje broja gena u ovoj porodici. U literaturi je objavljeno da segmentalna duplikacija može učinkovito potaknuti amplifikaciju članova porodice gena GRF u Arabidopsisu i jagodama, a nije pronađena tandemska duplikacija ove porodice gena ni u jednoj vrsti27,39. Rezultati ove studije u skladu su s postojećim studijama o porodicama Arabidopsis thaliana i jagoda, što sugerira da porodica GRF može povećati broj gena i stvoriti nove gene putem segmentalne duplikacije u različitim biljkama.
U ovoj studiji identificirano je ukupno 34 BjGRF gena u gorušici, koji su podijeljeni u 3 podfamilije. Ovi geni pokazali su slične konzervirane motive i genske strukture. Analiza kolinearnosti otkrila je 48 parova duplikacija segmenata u gorušici. Promotorska regija BjGRF sadrži cis-djelujuće elemente povezane s odgovorom na svjetlo, hormonalnim odgovorom, odgovorom na okolišni stres te rastom i razvojem. Ekspresija 34 BjGRF gena otkrivena je u fazi sadnice gorušice (korijenje, stabljike, listovi), a obrazac ekspresije 10 BjGRF gena u uvjetima suše. Utvrđeno je da su obrasci ekspresije BjGRF gena pod stresom suše slični i mogu biti slični. Geni BjGRF03 i BjGRF32 mogu igrati pozitivnu regulatornu ulogu u stresu suše, dok BjGRF06 i BjGRF23 igraju ulogu u stresu suše kao ciljni geni miR396. Sveukupno, naša studija pruža biološku osnovu za buduće otkrivanje funkcije BjGRF gena u biljkama Brassicaceae.
Sjemenke gorušice korištene u ovom eksperimentu osigurao je Guizhou Oil Seed Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. Odaberite cijele sjemenke i posadite ih u tlo (supstrat:tlo = 3:1), te sakupite korijenje, stabljike i listove nakon faze s četiri lista. Biljke su tretirane s 20% PEG 6000 kako bi se simulirala suša, a listovi su sakupljeni nakon 0, 3, 6, 12 i 24 sata. Svi uzorci biljaka odmah su zamrznuti u tekućem dušiku, a zatim pohranjeni u zamrzivaču na -80°C za sljedeći test.
Svi podaci dobiveni ili analizirani tijekom ove studije uključeni su u objavljeni članak i dodatne informativne datoteke.
Vrijeme objave: 22. siječnja 2025.