Biljni i patogeni materijali
Populaciju za mapiranje povezanosti sirka poznatu kao populacija konverzije sirka (SCP) osigurao je dr. Pat Brown sa Sveučilišta Illinois (sada na UC Davis).Prethodno je opisano i zbirka je različitih linija pretvorenih u neosjetljivost na fotoperiod i manji rast kako bi se olakšao rast i razvoj biljaka u američkim sredinama.U ovoj studiji korišteno je 510 linija iz ove populacije, iako zbog loše klijavosti i drugih problema s kontrolom kvalitete nisu sve linije korištene u analizi sva tri svojstva.Naposljetku, podaci iz 345 linija korišteni su za analizu hitinskog odgovora, 472 linije za flg22 odgovor i 456 za otpornost na TLS.B. kolačićsoj LSLP18 dobiven je od dr. Burta Bluhma sa Sveučilišta Arkansas.
mjerenje MAMP odziva
Dva različita MAMP-a korištena su u ovoj studiji flg22, (Genscript katalog # RP19986), i hitin.Biljke sirka uzgajane su u umetcima položenim na stanove ispunjene zemljom (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) u stakleniku.Biljke su zalijevane dan prije sakupljanja uzoraka kako bi se izbjegla dodatna vlaga lišća na dan sakupljanja.
Linije su nasumično raspoređene i, iz logističkih razloga, posađene su u serijama od 60 linija.Za svaku liniju posađene su tri 'posudice' s po dvije sjemenke po liniji.Sljedeće serije posađene su čim je prethodna serija obrađena dok se ne procijeni cijela populacija.Provedena su dva eksperimentalna ciklusa za oba MAMP-a s genotipovima ponovno randomiziranim u svakom od dva ciklusa.
ROS testovi su provedeni kao što je prethodno opisano.Ukratko, za svaku liniju posađeno je šest sjemenki u 3 različite posude.Od dobivenih sadnica odabrane su tri prema ujednačenosti.Nisu korištene sadnice koje su izgledale neobično ili su bile znatno više ili niže od većine.Četiri lisna diska promjera 3 mm izrezana su iz najšireg dijela 4. lista tri različite biljke sirka stare 15 dana.Jedan disk po listu od dvije biljke i dva diska od jedne biljke, pri čemu drugi disk postaje kontrola vode (vidi dolje).Diskovi su pojedinačno plutani na 50 µl H20 u crnoj ploči s 96 jažica, zapečaćeni aluminijskim zatvaračem kako bi se izbjeglo izlaganje svjetlu i držani na sobnoj temperaturi preko noći.Sljedećeg jutra napravljena je reakcijska otopina pomoću 2 mg/ml kemiluminescentne sonde L-012 (Wako, kataloški broj 120-04891), 2 mg/ml peroksidaze hrena (Tip VI-A, Sigma-Aldrich, kataloški # P6782) i 100 mg/ml hitina ili 2 μM Flg22.50 ul ove reakcijske otopine dodano je u tri od četiri jažice.Četvrta jažica bila je lažna kontrola, kojoj je dodana reakcijska otopina bez MAMP-a.Četiri prazne jažice koje sadrže samo vodu također su uključene u svaku ploču.
Nakon dodavanja reakcijske otopine, luminiscencija je mjerena korištenjem SynergyTM 2 multi-detection čitača mikropločica (BioTek) svake 2 minute tijekom 1 sata.Čitač ploča provodi mjerenja luminiscencije svake 2 minute tijekom tog 1 sata.Zbroj svih 31 očitanja izračunat je kako bi se dobila vrijednost za svaku jažicu.Procijenjena vrijednost MAMP odgovora za svaki genotip izračunata je kao (prosječna vrijednost luminiscencije triju eksperimentalnih jažica—vrijednost lažne jažice) minus prosječna vrijednost prazne jažice.Vrijednosti praznih jažica bile su dosljedno blizu nule.
Listni diskovi odNicotiana benthamiana, jedna linija sirka s visokim odzivom (SC0003) i jedna linija sirka s niskim odzivom (PI 6069) također su uključene kao kontrole u svaku ploču s 96 jažica u svrhu kontrole kvalitete.
B. kolačićpriprema inokuluma i inokulacija
B. kolačićinokulum je pripremljen kako je prethodno opisano.Ukratko, zrna sirka su namočena u vodi tri dana, isprana, prebačena u konusne tikvice od 1L i autoklavirana sat vremena na 15 psi i 121 °C.Zrna su zatim inokulirana s oko 5 ml maceriranog micelija iz svježe kultureB. kolačićLSLP18 se izolira i ostavi 2 tjedna na sobnoj temperaturi, protresajući tikvice svaka 3 dana.Nakon 2 tjedna, zrna sirka zaražena gljivicama osušena su na zraku i zatim pohranjena na 4 °C do inokulacije u polju.Isti inokulum je korišten za cijelo ispitivanje i svake godine je bio svjež.Za inokulaciju, 6-10 inficiranih zrna stavljeno je u klupko 4-5 tjedana starih biljaka sirka.Spore proizvedene iz ovih gljiva pokrenule su infekciju u mladim biljkama sirka unutar tjedan dana.
Priprema sjemena
Prije sadnje u polje sjeme sirka je tretirano mješavinom fungicida, insekticida i zaštitnog sredstva koja sadrži ~ 1% fungicida Spirato 480 FS, 4% fungicida Sebring 480 FS, 3% zaštitnog sredstva za sjeme Sorpro 940 ES.Zatim su sjemenke sušene na zraku 3 dana što je omogućilo tanak sloj ove mješavine oko sjemenki.Safener je omogućio upotrebu herbicida Dual Magnum kao tretmana prije nicanja.
Procjena otpornosti na ciljnu pjegavost lišća
SCP je posađen u Central Crops Research Station u Claytonu, NC 14. – 15. lipnja 2017. i 20. lipnja 2018. u nasumičnom kompletnom blok dizajnu s dva eksperimentalna ponavljanja u svakom slučaju.Eksperimenti su posađeni u jednoredove na 1,8 m sa širinom reda od 0,9 m uz korištenje 10 sjemenki po parceli.Dva granična reda posađena su oko periferije svakog eksperimenta kako bi se spriječili rubni učinci.Pokusi su inokulirani 20. srpnja 2017. i 20. srpnja 2018. kada su biljke sirka bile u fazi rasta 3. Ocjene su uzete na ljestvici od jedan do devet, gdje su biljke koje nisu pokazivale znakove bolesti ocijenjene kao devet i potpuno mrtve biljke ocijenjene su kao jedna.Dvije ocjene su napravljene 2017. i četiri očitavanja 2018. počevši od dva tjedna nakon cijepljenja svake godine.sAUDPC (standardizirano područje ispod krivulje progresije bolesti) izračunato je kako je prethodno opisano.
Vrijeme objave: 1. travnja 2021