Biljni i patogeni materijali
Populaciju za mapiranje asocijacije sirka poznatu kao populacija konverzije sirka (SCP) osigurao je dr. Pat Brown sa Sveučilišta Illinois (sada na UC Davis). Prethodno je opisana i predstavlja zbirku različitih linija pretvorenih u neosjetljivost na fotoperiod i manji rast kako bi se olakšao rast i razvoj biljaka u američkim okruženjima. U ovoj studiji korišteno je 510 linija iz ove populacije, iako zbog loše klijavosti i drugih problema s kontrolom kvalitete, nisu sve linije korištene u analizi sve tri osobine. Konačno, podaci iz 345 linija korišteni su za analizu odgovora na hitin, 472 linije za odgovor na flg22 i 456 za otpornost na TLS.B. cookeiSoj LSLP18 dobiven je od dr. Burta Bluhma sa Sveučilišta u Arkansasu.
Mjerenje MAMP odgovora
U ovoj studiji korištena su dva različita MAMP-a flg22 (Genscript katalog # RP19986) i hitin. Biljke sirka uzgajane su u umetcima položenim na ravnim površinama napunjenim zemljom (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) u stakleniku. Biljke su zalijevane dan prije uzimanja uzorka kako bi se izbjegla dodatna vlaga lišća na dan uzimanja.
Linije su bile randomizirane i, iz logističkih razloga, posađene su u serijama od 60 linija. Za svaku liniju, posađene su tri 'posude' s dva sjemena po liniji. Sljedeće serije su posađene čim je prethodna serija obrađena sve dok nije procijenjena cijela populacija. Provedena su dva eksperimentalna ciklusa za oba MAMP-a s genotipovima ponovno randomiziranim u svakom od dva ciklusa.
ROS testovi provedeni su kako je prethodno opisano. Ukratko, za svaku liniju, šest sjemenki posađeno je u 3 različite posude. Iz dobivenih sadnica, tri su odabrane na temelju ujednačenosti. Sadnice koje su izgledale neobično ili su bile značajno više ili niže od većine nisu korištene. Četiri diska lista promjera 3 mm izrezana su iz najšireg dijela 4. lista triju različitih 15 dana starih biljaka sirka. Jedan disk po listu s dvije biljke i dva diska s jedne biljke, pri čemu je drugi disk postao kontrola s vodom (vidi dolje). Diskovi su pojedinačno plutali na 50 µl H20 u crnoj ploči s 96 jažica, zatvoreni aluminijskim brtvom kako bi se izbjeglo izlaganje svjetlosti i držani na sobnoj temperaturi preko noći. Sljedećeg jutra pripremljena je reakcijska otopina korištenjem 2 mg/ml kemiluminiscentne sonde L-012 (Wako, kataloški broj 120-04891), 2 mg/ml peroksidaze iz hrena (tip VI-A, Sigma-Aldrich, kataloški broj P6782) i 100 mg/ml hitina ili 2 μM Flg22. 50 µl ove reakcijske otopine dodano je u tri od četiri jažice. Četvrta jažica bila je lažna kontrola, kojoj je dodana reakcijska otopina isključujući MAMP. U svaku ploču uključene su i četiri slijepe jažice koje su sadržavale samo vodu.
Nakon dodavanja reakcijske otopine, luminiscencija je mjerena pomoću SynergyTM 2 višedetektorskog čitača mikroploča (BioTek) svake 2 minute tijekom 1 sata. Čitač ploča mjeri luminiscenciju svake 2 minute tijekom tog 1 sata. Zbroj svih 31 očitanja izračunat je kako bi se dobila vrijednost za svaku jažicu. Procijenjena vrijednost MAMP odgovora za svaki genotip izračunata je kao (prosječna vrijednost luminiscencije tri eksperimentalna jažica - vrijednost u probnoj jažici) - minus prosječna vrijednost u slijepoj jažici. Vrijednosti u slijepoj jažici bile su dosljedno blizu nule.
Listni diskoviNicotiana benthamiana, jedna linija sirka visoke osjetljivosti (SC0003) i jedna linija sirka niske osjetljivosti (PI 6069) također su uključene kao kontrole u svaku ploču s 96 jažica u svrhu kontrole kvalitete.
B. cookeipriprema inokuluma i inokulacija
B. cookeiInokulum je pripremljen kako je prethodno opisano. Ukratko, zrna sirka su natopljena u vodi tri dana, isprana, prebačena u konusne tikvice od 1 l i autoklavirana sat vremena na 15 psi i 121 °C. Zrna su zatim inokulirana s oko 5 ml maceriranog micelija iz svježe kultureB. cookeiIzolate LSLP18 i ostavljene 2 tjedna na sobnoj temperaturi, uz protresanje tikvica svaka 3 dana. Nakon 2 tjedna, zrna sirka zaražena gljivicom osušena su na zraku, a zatim pohranjena na 4 °C do inokulacije na polju. Isti inokulum korišten je za cijelo ispitivanje i pripremao se svjež svake godine. Za inokulaciju je 6-10 zaraženih zrna stavljeno u pršljen biljaka sirka starih 4-5 tjedana. Spore proizvedene od ovih gljivica pokrenule su infekciju u mladim biljkama sirka unutar tjedan dana.
Priprema sjemena
Prije sadnje u polje, sjeme sirka tretirano je mješavinom fungicida, insekticida i zaštitnih sredstava koja je sadržavala ~ 1% fungicida Spirato 480 FS, 4% fungicida Sebring 480 FS i 3% zaštitnih sredstava za sjeme Sorpro 940 ES. Zatim je sjeme sušeno na zraku 3 dana, što je osiguralo tanki sloj ove mješavine oko sjemena. Zaštitno sredstvo omogućilo je upotrebu herbicida Dual Magnum kao tretmana prije nicanja.
Procjena otpornosti na ciljanu pjegavost lišća
SCP je zasađen u Centralnoj istraživačkoj stanici za usjeve u Claytonu, NC, 14. i 15. lipnja 2017. i 20. lipnja 2018. po randomiziranom dizajnu potpunog bloka s dva eksperimentalna ponavljanja u svakom slučaju. Pokusi su zasađeni u pojedinačne redove od 1,8 m sa širinom reda od 0,9 m, koristeći 10 sjemenki po parceli. Dva granična reda zasađena su oko periferije svakog pokusa kako bi se spriječili rubni efekti. Pokusi su inokulirani 20. srpnja 2017. i 20. srpnja 2018., kada su biljke sirka bile u fazi rasta 3. Ocjene su uzete na ljestvici od jedan do devet, gdje su biljke koje ne pokazuju znakove bolesti ocijenjene s devet, a potpuno mrtve biljke s jedan. Dvije ocjene su uzete 2017., a četiri očitanja 2018., počevši dva tjedna nakon inokulacije svake godine. sAUDPC (standardizirana površina ispod krivulje progresije bolesti) izračunata je kako je prethodno opisano.
Vrijeme objave: 01.04.2021.