Borova nematoda je karantenski migratorni endoparazit poznat po tome što uzrokuje ozbiljne ekonomske gubitke u ekosustavima borovih šuma. Ova studija pregledava nematocidno djelovanje halogeniranih indola protiv borovih nematoda i njihov mehanizam djelovanja. Nematocidno djelovanje 5-jodoindola i avermektina (pozitivna kontrola) protiv borovih nematoda bilo je slično i visoko pri niskim koncentracijama (10 μg/mL). 5-jodoindol je smanjio plodnost, reproduktivnu aktivnost, embrionalnu i larvalnu smrtnost te lokomotorno ponašanje. Molekularne interakcije liganada s beskralježnjački specifičnim receptorima glutamatnih kloridnih kanala podupiru ideju da se 5-jodoindol, poput avermektina, čvrsto veže za aktivno mjesto receptora. 5-jodoindol je također izazvao različite fenotipske deformacije kod nematoda, uključujući abnormalni kolaps/skupljanje organa i povećanu vakuolizaciju. Ovi rezultati sugeriraju da vakuole mogu igrati ulogu u smrti posredovanoj metilacijom nematoda. Važno je da 5-jodoindol nije bio toksičan za obje biljne vrste (kupus i rotkvica). Dakle, ova studija pokazuje da primjena jodoindola u uvjetima okoline može kontrolirati oštećenja uzrokovana uvenućem bora.
Borova nematoda (Bursaphelenchus xylophilus) pripada borovim nematodama (PWN), migratornim endoparazitskim nematodama poznatim po tome što uzrokuju ozbiljnu ekološku štetu ekosustavima borovih šuma1. Bolest uvenuća borova (PWD) koju uzrokuje borova nematoda postaje ozbiljan problem na nekoliko kontinenata, uključujući Aziju i Europu, a u Sjevernoj Americi nematoda uništava unesene vrste borova1,2. Propadanje borova glavni je ekonomski problem, a izgledi za njezino globalno širenje su zabrinjavajući3. Sljedeće vrste borova najčešće su napadnute nematodom: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Borova nematoda je ozbiljna bolest koja može ubiti borove u roku od nekoliko tjedana ili mjeseci od zaraze. Osim toga, izbijanja borovih nematoda česta su u raznim ekosustavima, pa su uspostavljeni trajni lanci infekcije1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantenska biljno-parazitska nematoda koja pripada superporodici Aphelenchoidea i kladu 102.5. Nematoda se hrani gljivicama i razmnožava u drvenastom tkivu borova, razvijajući se u četiri različita larvalna stadija: L1, L2, L3, L4 i odraslu jedinku1,6. U uvjetima nedostatka hrane, borova nematoda prelazi u specijalizirani larvalni stadij – dauer, koji parazitira na svom vektoru – borovom potkornjaku (Monochamus alternatus) i prenosi se na zdrave borove. U zdravih domaćina, nematode brzo migriraju kroz biljna tkiva i hrane se parenhimskim stanicama, što dovodi do niza reakcija preosjetljivosti, venuća bora i uginuća unutar godine dana nakon infekcije1,7,8.
Biološka kontrola borovih nematoda dugo je predstavljala izazov, a karantenske mjere datiraju još iz 20. stoljeća. Trenutne strategije za kontrolu borovih nematoda prvenstveno uključuju kemijske tretmane, uključujući fumigaciju drva i implantaciju nematicida u debla drveća. Najčešće korišteni nematicidi su avermektin i avermektin benzoat, koji pripadaju porodici avermektina. Ove skupe kemikalije vrlo su učinkovite protiv mnogih vrsta nematoda i smatraju se sigurnima za okoliš9. Međutim, očekuje se da će ponovljena upotreba ovih nematicida stvoriti selekcijski pritisak koji će gotovo sigurno dovesti do pojave otpornih borovih nematoda, kao što je dokazano za nekoliko štetnika insekata, kao što su Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella te nematode Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, koje su postupno razvile otpornost na avermektine10,11,12. Stoga je potrebno redovito proučavati obrasce otpornosti i kontinuirano provjeravati nematicide kako bi se pronašle alternativne, isplative i ekološki prihvatljive mjere za kontrolu PVD-a. U posljednjim desetljećima, brojni autori predložili su upotrebu biljnih ekstrakata, eteričnih ulja i hlapljivih tvari kao sredstava za suzbijanje nematoda13,14,15,16.
Nedavno smo pokazali nematicidno djelovanje indola, međustanične i međucarstvene signalne molekule, u Caenorhabditis elegans 17. Indol je široko rasprostranjeni unutarstanični signal u mikrobnoj ekologiji, koji kontrolira brojne funkcije koje utječu na mikrobnu fiziologiju, stvaranje spora, stabilnost plazmida, otpornost na lijekove, stvaranje biofilma i virulenciju 18, 19. Djelovanje indola i njegovih derivata protiv drugih patogenih nematoda nije proučavano. U ovoj studiji istražili smo nematicidno djelovanje 34 indola protiv borovih nematoda i razjasnili mehanizam djelovanja najpotentnijeg 5-jodoindola pomoću mikroskopije, time-lapse fotografije i eksperimenata molekularnog spajanja te procijenili njegove toksične učinke na biljke pomoću testa klijanja sjemena.
Prethodno je zabilježeno da visoke koncentracije (>1,0 mM) indola imaju nematocidni učinak na nematode17. Nakon tretmana B. xylophilus (mješoviti životni stadiji) indolom ili 33 različita derivata indola pri 1 mM, smrtnost B. xylophilusa mjerena je brojanjem živih i mrtvih nematoda u kontrolnoj i tretiranoj skupini. Pet indola pokazalo je značajnu nematocidnu aktivnost; preživljavanje netretirane kontrolne skupine bilo je 95 ± 7% nakon 24 sata. Od 34 testirana indola, 5-jodoindol i 4-fluoroindol pri 1 mM uzrokovali su 100% smrtnosti, dok su 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat i 7-jodoindol uzrokovali približno 50% smrtnosti (Tablica 1).
Učinak 5-jodoindola na stvaranje vakuola i metabolizam borove nematode. (A) Učinak avermektina i 5-jodoindola na odrasle mužjake nematode, (B) jaja nematode L1 stadija i (C) metabolizam B. xylophilus, (i) vakuole nisu uočene u 0 sati, tretman je rezultirao (ii) vakuolama, (iii) nakupljanjem više vakuola, (iv) oticanjem vakuola, (v) fuzijom vakuola i (vi) stvaranjem divovskih vakuola. Crvene strelice označavaju oticanje vakuola, plave strelice označavaju fuziju vakuola, a crne strelice označavaju divovske vakuole. Mjerilo = 50 μm.
Osim toga, ova studija je također opisala sekvencijalni proces smrti izazvane metanom kod borovih nematoda (Slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotski tip stanične smrti povezan s nakupljanjem istaknutih citoplazmatskih vakuola27. Čini se da su morfološki defekti uočeni kod borovih nematoda usko povezani s mehanizmom smrti izazvane metanom. Mikroskopski pregled u različitim vremenima pokazao je da su se divovske vakuole formirale nakon 20 sati izlaganja 5-jodoindolu (0,1 mM). Mikroskopske vakuole uočene su nakon 8 sati tretmana, a njihov se broj povećao nakon 12 sati. Nekoliko velikih vakuola uočeno je nakon 14 sati. Nekoliko spojenih vakuola bilo je jasno vidljivo nakon 12-16 sati tretmana, što ukazuje na to da je fuzija vakuola osnova mehanizma metanogene smrti. Nakon 20 sati, nekoliko divovskih vakuola pronađeno je po cijelom crvu. Ova opažanja predstavljaju prvo izvješće o metuozi kod C. elegans.
Kod crva tretiranih 5-jodoindolom, također je uočena agregacija i ruptura vakuola (slika 5), što je vidljivo savijanjem crva i oslobađanjem vakuola u okoliš. Poremećaj vakuola također je uočen u membrani ljuske jajeta, koju L2 normalno čuva netaknutom tijekom izleganja (dodatna slika S2). Ova opažanja podupiru uključenost nakupljanja tekućine i osmoregulacijskog neuspjeha, kao i reverzibilnog oštećenja stanica (RCI), u proces stvaranja vakuola i gnojenja (slika 5).
Postavljajući hipotezu o ulozi joda u opaženom stvaranju vakuola, istražili smo nematicidno djelovanje natrijevog jodida (NaI) i kalijevog jodida (KI). Međutim, pri koncentracijama (0,1, 0,5 ili 1 mM), nisu utjecali ni na preživljavanje nematoda ni na stvaranje vakuola (Dodatna slika S5), iako je 1 mM KI imao blagi nematicidni učinak. S druge strane, 7-jodoindol (1 ili 2 mM), poput 5-jodoindola, izazvao je višestruke vakuole i strukturne deformacije (Dodatna slika S6). Dva jodoindola pokazala su slične fenotipske karakteristike kod borovih nematoda, dok NaI i KI nisu. Zanimljivo je da indol nije izazvao stvaranje vakuola kod B. xylophilus pri testiranim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Dakle, rezultati su potvrdili da je kompleks indol-jod odgovoran za vakuolizaciju i metabolizam B. xylophilus.
Među indolima testiranim na nematocidnu aktivnost, 5-jodoindol je imao najveći indeks klizanja od -5,89 kcal/mol, a slijede ga 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) i indol (-4,03) (Slika 6). Jaka vodikova veza 5-jodoindola s leucinom 218 stabilizira njegovo vezanje, dok se svi ostali derivati indola vežu za serin 260 putem vodikovih veza bočnog lanca. Među ostalim modeliranim jodoindolima, 2-jodoindol ima vrijednost vezanja od -5,248 kcal/mol, što je zbog njegove glavne vodikove veze s leucinom 218. Druga poznata vezanja uključuju 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) i 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Dodatna slika S8). Većina halogeniranih indola i sam indol, s izuzetkom 5-jodoindola i 2-jodoindola, tvore vezu sa serinom 260. Činjenica da vodikova veza s leucinom 218 ukazuje na učinkovito vezanje receptora i liganda, kao što je uočeno kod ivermektina (dodatna slika S7), potvrđuje da se 5-jodoindol i 2-jodoindol, poput ivermektina, čvrsto vežu za aktivno mjesto GluCL receptora putem leucina 218 (slika 6 i dodatna slika S8). Pretpostavljamo da je ovo vezanje potrebno za održavanje otvorene strukture pora GluCL kompleksa i da čvrstim vezanjem za aktivno mjesto GluCL receptora, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin i ivermektin tako održavaju ionski kanal otvorenim i omogućuju unos tekućine.
Molekularno spajanje indola i halogeniranog indola s GluCL-om. Orijentacije vezanja liganada (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola i (D) 5-jodoindola na aktivno mjesto GluCL-a. Protein je predstavljen vrpcom, a vodikove veze u glavnom lancu prikazane su žutim isprekidanim linijama. (A′), (B′), (C′) i (D′) prikazuju interakcije odgovarajućih liganada s okolnim aminokiselinskim ostacima, a vodikove veze u bočnim lancima označene su ružičastim isprekidanim strelicama.
Provedeni su pokusi kako bi se procijenio toksični učinak 5-jodoindola na klijanje sjemenki kupusa i rotkvice. 5-jodoindol (0,05 ili 0,1 mM) ili avermektin (10 μg/mL) imali su mali ili nikakav učinak na početno klijanje i nicanje biljčica (Slika 7). Osim toga, nije pronađena značajna razlika između stope klijanja netretiranih kontrola i sjemena tretiranog 5-jodoindolom ili avermektinom. Učinak na izduživanje glavnog korijena i broj formiranih bočnih korijena bio je beznačajan, iako je 1 mM (10 puta veća od aktivne koncentracije) 5-jodoindola neznatno odgodio razvoj bočnih korijena. Ovi rezultati ukazuju na to da 5-jodoindol nije toksičan za biljne stanice i ne ometa procese razvoja biljaka pri proučavanim koncentracijama.
Učinak 5-jodoindola na klijanje sjemena. Klijanje, nicanje i bočno ukorjenjivanje sjemena B. oleracea i R. raphanistrum na Murashige i Skoog agar mediju sa ili bez avermektina ili 5-jodoindola. Klijanje je zabilježeno nakon 3 dana inkubacije na 22°C.
Ova studija izvještava o nekoliko slučajeva ubijanja nematoda indolima. Važno je napomenuti da je ovo prvo izvješće o metilaciji koju inducira jodoindol (proces uzrokovan nakupljanjem malih vakuola koje se postupno spajaju u divovske vakuole, što na kraju dovodi do pucanja membrane i smrti) u borovim iglicama, pri čemu jodoindol pokazuje značajna nematicidna svojstva slična onima komercijalnog nematicida avermektina.
Prethodno je objavljeno da indoli imaju višestruke signalne funkcije u prokariotima i eukariotima, uključujući inhibiciju/stvaranje biofilma, preživljavanje bakterija i patogenost 19, 32, 33, 34. Nedavno su potencijalni terapijski učinci halogeniranih indola, indolnih alkaloida i polusintetskih derivata indola privukli opsežan istraživački interes 35, 36, 37. Na primjer, pokazalo se da halogenirani indoli ubijaju perzistentne stanice Escherichia coli i Staphylococcus aureus 37. Osim toga, od znanstvenog je interesa proučiti učinkovitost halogeniranih indola protiv drugih vrsta, rodova i carstava, a ova studija je korak prema postizanju tog cilja.
Ovdje predlažemo mehanizam za smrtnost izazvanu 5-jodoindolom kod C. elegans na temelju reverzibilnog oštećenja stanica (RCI) i metilacije (slike 4C i 5). Edematozne promjene poput natečenosti i vakuolarne degeneracije pokazatelji su RCI i metilacije, a manifestiraju se kao divovske vakuole u citoplazmi48,49. RCI ometa proizvodnju energije smanjenjem proizvodnje ATP-a, uzrokujući zatajenje ATPazne pumpe ili narušavanjem staničnih membrana i uzrokujući brzi priljev Na+, Ca2+ i vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastaju u životinjskim stanicama kao rezultat nakupljanja tekućine u citoplazmi zbog priljeva Ca2+ i vode53. Zanimljivo je da je ovaj mehanizam oštećenja stanica reverzibilan ako je oštećenje privremeno i stanice počnu proizvoditi ATP određeno vrijeme, ali ako oštećenje traje ili se pogorša, stanice umiru.54 Naša opažanja pokazuju da nematode tretirane 5-jodoindolom nisu u stanju vratiti normalnu biosintezu nakon izlaganja stresnim uvjetima.
Metilacijski fenotip induciran 5-jodoindolom u B. xylophilus može biti posljedica prisutnosti joda i njegove molekularne distribucije, budući da je 7-jodoindol imao manji inhibitorni učinak na B. xylophilus nego 5-jodoindol (Tablica 1 i Dodatna slika S6). Ovi rezultati djelomično su u skladu sa studijama Maltesea i suradnika (2014.), koji su izvijestili da je translokacija piridil dušikovog dijela u indolu iz para- u meta-položaj ukinula vakuolizaciju, inhibiciju rasta i citotoksičnost u stanicama U251, što sugerira da je interakcija molekule sa specifičnim aktivnim mjestom u proteinu kritična27,44,45. Interakcije između indola ili halogeniranih indola i GluCL receptora uočene u ovoj studiji također podupiru ovu ideju, jer je utvrđeno da se 5- i 2-jodoindol jače vežu za GluCL receptore od ostalih ispitivanih indola (Slika 6 i Dodatna slika S8). Utvrđeno je da se jod na drugom ili petom položaju indola veže na leucin 218 GluCL receptora putem vodikovih veza u glavnom lancu, dok drugi halogenirani indoli i sam indol tvore slabe vodikove veze u bočnim lancima sa serinom 260 (Slika 6). Stoga nagađamo da lokalizacija halogena igra važnu ulogu u indukciji vakuolarne degeneracije, dok čvrsto vezanje 5-jodoindola održava ionski kanal otvorenim, omogućujući time brzi protok tekućine i rupturu vakuole. Međutim, detaljan mehanizam djelovanja 5-jodoindola tek treba utvrditi.
Prije praktične primjene 5-jodoindola, treba analizirati njegov toksični učinak na biljke. Naši pokusi klijanja sjemena pokazali su da 5-jodoindol nije imao negativan učinak na klijanje sjemena ili naknadne razvojne procese pri proučavanim koncentracijama (Slika 7). Stoga ova studija pruža osnovu za upotrebu 5-jodoindola u ekološkom okruženju za kontrolu štetnosti borovih nematoda za borove.
Prethodna izvješća pokazala su da terapija na bazi indola predstavlja potencijalni pristup rješavanju problema otpornosti na antibiotike i progresije raka55. Osim toga, indoli posjeduju antibakterijska, antikancerogena, antioksidativna, protuupalna, antidijabetička, antivirusna, antiproliferativna i antituberkulozna djelovanja te mogu poslužiti kao obećavajuća osnova za razvoj lijekova56,57. Ova studija prvi put sugerira potencijalnu upotrebu joda kao antiparazitskog i antihelmintskog sredstva.
Avermektin je otkriven prije tri desetljeća i osvojio je Nobelovu nagradu 2015. godine, a njegova upotreba kao antihelmintika još uvijek je aktivno u tijeku. Međutim, zbog brzog razvoja otpornosti na avermektine kod nematoda i insekata štetnika, potrebna je alternativna, jeftina i ekološki prihvatljiva strategija za kontrolu infekcije borovom biljkom. Ova studija također izvještava o mehanizmu kojim 5-jodoindol ubija borove nematode i da 5-jodoindol ima nisku toksičnost za biljne stanice, što otvara dobre izglede za njegovu buduću komercijalnu primjenu.
Sve eksperimente odobrio je Etički odbor Sveučilišta Yeungnam u Gyeongsanu u Koreji, a metode su provedene u skladu sa smjernicama Etičkog odbora Sveučilišta Yeungnam.
Eksperimenti inkubacije jaja provedeni su korištenjem utvrđenih postupaka43. Za procjenu stope izleganja (HR), jednodnevne odrasle nematode (otprilike 100 ženki i 100 mužjaka) prenesene su u Petrijeve zdjelice koje su sadržavale gljivicu i ostavljene da rastu 24 sata. Jaja su zatim izolirana i tretirana 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) kao suspenzija u sterilnoj destiliranoj vodi. Ove suspenzije (500 μl; otprilike 100 jaja) prenesene su u jažice ploče za kulturu tkiva s 24 jažice i inkubirane na 22 °C. Brojanje L2 stanica provedeno je nakon 24 sata inkubacije, ali su smatrane mrtvima ako se stanice nisu pomicale kada su stimulirane finom platinskom žicom. Ovaj eksperiment proveden je u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta kombinirani su i prikazani. Postotak HR izračunava se na sljedeći način:
Mortalitet ličinki procijenjen je korištenjem prethodno razvijenih postupaka. Jaja nematoda su prikupljena, a embriji su sinkronizirani izleganjem u sterilnoj destiliranoj vodi kako bi se stvorile ličinke L2 stadija. Sinkronizirane ličinke (približno 500 nematoda) tretirane su 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) i uzgajane na Petrijevim pločama B. cinerea. Nakon 48 sati inkubacije na 22 °C, nematode su prikupljene u sterilnoj destiliranoj vodi i pregledane na prisutnost stadija L2, L3 i L4. Prisutnost stadija L3 i L4 ukazivala je na transformaciju ličinke, dok prisutnost stadija L2 nije ukazivala na transformaciju. Slike su dobivene korištenjem iRiS™ Digital Cell Imaging Systema. Ovaj eksperiment proveden je u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinirani i prikazani.
Toksičnost 5-jodoindola i avermektina za sjeme procijenjena je pomoću testova klijanja na Murashige i Skoog agar pločama.62 Sjeme B. oleracea i R. raphanistrum prvo je natopljeno u sterilnoj destiliranoj vodi jedan dan, isprano s 1 ml 100%-tnog etanola, sterilizirano s 1 ml 50%-tnog komercijalnog izbjeljivača (3% natrijevog hipoklorita) tijekom 15 minuta i isprano pet puta s 1 ml sterilne vode. Sterilizirano sjeme je zatim prešano na agar ploče za klijanje koje su sadržavale 0,86 g/l (0,2X) Murashige i Skoog medija i 0,7% bakteriološkog agara sa ili bez 5-jodoindola ili avermektina. Ploče su zatim inkubirane na 22 °C, a slike su snimljene nakon 3 dana inkubacije. Ovaj eksperiment proveden je u dvije faze, od kojih je svaka imala šest ponavljanja.
Vrijeme objave: 26. veljače 2025.