Borova nematoda je karantenski migratorni endoparazit za kojeg se zna da uzrokuje ozbiljne ekonomske gubitke u ekosustavima borove šume. Ova studija prikazuje nematicidno djelovanje halogeniranih indola protiv borovih nematoda i njihov mehanizam djelovanja. Nematicidno djelovanje 5-jodoindola i avermektina (pozitivna kontrola) protiv borovih nematoda bilo je slično i visoko pri niskim koncentracijama (10 μg/mL). 5-jodoindol smanjuje plodnost, reproduktivnu aktivnost, smrtnost embrija i ličinki te lokomotorno ponašanje. Molekularne interakcije liganada s receptorima kloridnih kanala specifičnih za glutamatne kanale podupiru ideju da se 5-jodoindol, poput avermektina, čvrsto veže na aktivno mjesto receptora. 5-jodoindol je također izazvao različite fenotipske deformacije u nematoda, uključujući abnormalno kolaps/skupljanje organa i povećanu vakuolizaciju. Ovi rezultati sugeriraju da vakuole mogu igrati ulogu u smrti nematoda posredovanoj metilacijom. Važno je da je 5-jodoindol bio netoksičan za obje biljne vrste (kupus i rotkvicu). Dakle, ova studija pokazuje da primjena jodoindola u uvjetima okoliša može kontrolirati ozljede od venuća bora.
Borova nematoda (Bursaphelenchus xylophilus) pripada nematodama borove šume (PWN), migratornim endoparazitnim nematodama za koje je poznato da uzrokuju ozbiljne ekološke štete ekosustavima borovih šuma1. Bolest venuća bora (PWD) uzrokovana nematodom borovog drva postaje ozbiljan problem na nekoliko kontinenata, uključujući Aziju i Europu, au Sjevernoj Americi nematoda uništava unesene vrste bora1,2. Propadanje bora veliki je gospodarski problem, a izgledi za njegovo globalno širenje su zabrinjavajući3. Sljedeće vrste bora su najčešće napadnute nematodama: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Borova nematoda je ozbiljna bolest koja može ubiti borove nekoliko tjedana ili mjeseci nakon infekcije. Osim toga, izbijanja borovih nematoda česta su u raznim ekosustavima, tako da su uspostavljeni trajni lanci infekcije1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantenska biljno-parazitska nematoda koja pripada superporodici Aphelenchoidea i klasu 102.5. Nematoda se hrani gljivama i razmnožava u drvnom tkivu borova, razvijajući se u četiri različita stadija ličinke: L1, L2, L3, L4 i odraslu jedinku1,6. U uvjetima nedostatka hrane borova nematoda prelazi u specijalizirani larvalni stadij – dauer, koji parazitira na svom vektoru – borovom potkornjaku (Monochamus alternatus) i prenosi se na zdrava stabla bora. Kod zdravih domaćina nematode brzo migriraju kroz biljna tkiva i hrane se parenhimskim stanicama, što dovodi do niza reakcija preosjetljivosti, venuća bora i smrti unutar godinu dana nakon infekcije1,7,8.
Biološka kontrola borovih nematoda dugo je bila izazov, a mjere karantene datiraju još iz 20. stoljeća. Trenutne strategije za kontrolu borovih nematoda primarno uključuju kemijske tretmane, uključujući fumigaciju drva i implantaciju nematicida u debla. Najčešće korišteni nematicidi su avermektin i avermektin benzoat, koji pripadaju obitelji avermektina. Ove skupe kemikalije vrlo su učinkovite protiv mnogih vrsta nematoda i smatraju se sigurnima za okoliš9. Međutim, očekuje se da će opetovana uporaba ovih nematicida stvoriti selekcijski pritisak koji će gotovo sigurno dovesti do pojave rezistentnih borovih nematoda, kao što je pokazano za nekoliko insekata štetnika, kao što su Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella i nematode Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, koje su postupno razvile otpornost na avermektini 10,11,12. Stoga je potrebno redovito proučavati obrasce rezistencije i kontinuirano provjeravati nematicide kako bi se pronašle alternativne, isplative i ekološki prihvatljive mjere za kontrolu PVD-a. Posljednjih desetljeća brojni su autori predložili upotrebu biljnih ekstrakata, eteričnih ulja i hlapljivih tvari kao sredstava za kontrolu nematoda13,14,15,16.
Nedavno smo pokazali nematicidnu aktivnost indola, međustanične i međukraljevske signalne molekule, u Caenorhabditis elegans 17 . Indol je široko rasprostranjen unutarstanični signal u mikrobnoj ekologiji, kontrolira brojne funkcije koje utječu na mikrobnu fiziologiju, stvaranje spora, stabilnost plazmida, otpornost na lijekove, stvaranje biofilma i virulentnost 18, 19 . Djelovanje indola i njegovih derivata protiv drugih patogenih nematoda nije proučavano. U ovoj smo studiji istražili nematicidnu aktivnost 34 indola protiv borovih nematoda i razjasnili mehanizam djelovanja najjačeg 5-jodoindola koristeći mikroskopiju, time-lapse fotografiju i eksperimente s molekularnim spajanjem, te procijenili njegove toksične učinke na biljke pomoću testa klijavosti sjemena.
Prethodno je objavljeno da visoke koncentracije (>1,0 mM) indola imaju nematocidni učinak na nematode17. Nakon tretmana B. xylophilus (mješoviti životni stadiji) s indolom ili 33 različita derivata indola pri 1 mM, smrtnost B. xylophilus je mjerena brojanjem živih i mrtvih nematoda u kontrolnoj i tretiranoj skupini. Pet indola pokazalo je značajno nematicidno djelovanje; preživljenje neliječene kontrolne skupine bilo je 95 ± 7% nakon 24 h. Od 34 testirana indola, 5-jodoindol i 4-fluoroindol u koncentraciji od 1 mM uzrokovali su 100% smrtnost, dok su 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat i 7-jodoindol uzrokovali približno 50% smrtnost (tablica 1).
Učinak 5-jodoindola na stvaranje vakuola i metabolizam nematoda iz borovog drva. (A) Učinak avermektina i 5-jodoindola na odrasle muške nematode, (B) jajašca nematoda stadija L1 i (C) metabolizam B. xylophilus, (i) vakuole nisu uočene u 0 h, tretman je rezultirao (ii) vakuolama, (iii) nakupljanjem više vakuola, (iv) bubrenjem vakuola, (v) spajanje vakuola i (vi) stvaranje divovskih vakuola. Crvene strelice označavaju bubrenje vakuola, plave strelice označavaju spajanje vakuola, a crne strelice označavaju divovske vakuole. Mjerna traka = 50 μm.
Osim toga, ova je studija također opisala sekvencijalni proces smrti borovih nematoda izazvane metanom (Slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotski tip stanične smrti povezan s nakupljanjem istaknutih citoplazmatskih vakuola27. Čini se da su morfološki defekti uočeni u borovih nematoda usko povezani s mehanizmom smrti izazvane metanom. Mikroskopski pregled u različitim vremenima pokazao je da su divovske vakuole nastale nakon 20 sati izlaganja 5-jodoindolu (0,1 mM). Mikroskopske vakuole uočene su nakon 8 sati tretmana, a njihov broj se povećao nakon 12 sati. Nekoliko velikih vakuola uočeno je nakon 14 sati. Nekoliko spojenih vakuola bilo je jasno vidljivo nakon 12-16 sati tretmana, što ukazuje da je fuzija vakuola osnova mehanizma metanogene smrti. Nakon 20 sati, nekoliko divovskih vakuola pronađeno je u cijelom crvu. Ova zapažanja predstavljaju prvo izvješće o metuozi u C. elegans.
Kod crva tretiranih 5-jodindolom također je primijećena agregacija i pucanje vakuole (Slika 5), što je dokazano savijanjem crva i otpuštanjem vakuola u okoliš. Poremećaj vakuole također je primijećen u membrani ljuske jajeta, koju L2 normalno čuva netaknutom tijekom izlijeganja (dodatna slika S2). Ova zapažanja podupiru uključenost nakupljanja tekućine i osmoregulacijskog neuspjeha, kao i reverzibilne ozljede stanica (RCI), u procesu stvaranja vakuole i gnojenja (Slika 5).
Pretpostavljajući ulogu joda u promatranom nastanku vakuola, istražili smo nematicidno djelovanje natrijevog jodida (NaI) i kalijevog jodida (KI). Međutim, u koncentracijama (0,1, 0,5 ili 1 mM), nisu utjecali niti na preživljavanje nematoda niti na stvaranje vakuola (dodatna slika S5), iako je 1 mM KI imao blagi nematicidni učinak. S druge strane, 7-jodoindol (1 ili 2 mM), poput 5-jodoindola, inducira višestruke vakuole i strukturne deformacije (dodatna slika S6). Dva jodoindola pokazala su slične fenotipske karakteristike u borovim nematodama, dok NaI i KI nisu. Zanimljivo, indol nije inducirao stvaranje vakuola u B. xylophilus u testiranim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Dakle, rezultati su potvrdili da je kompleks indol-jod odgovoran za vakuolizaciju i metabolizam B. xylophilus.
Među indolima testiranim na nematicidno djelovanje, 5-jodoindol je imao najveći indeks klizanja od -5,89 kcal/mol, a slijede ga 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) i indol (-4,03) (Slika 6). Jaka glavna vodikova veza 5-jodoindola na leucin 218 stabilizira njegovo vezanje, dok se svi drugi derivati indola vežu na serin 260 preko vodikovih veza bočnog lanca. Među ostalim modeliranim jodoindolima, 2-jodoindol ima vrijednost vezanja od -5,248 kcal/mol, što je zbog njegove glavne vodikove veze s leucinom 218. Ostala poznata vezanja uključuju 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) i 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (dodatna slika S8). Većina halogeniranih indola i sam indol, s iznimkom 5-jodoindola i 2-jodoindola, stvaraju vezu sa serinom 260. Činjenica da je vodikova veza s leucinom 218 pokazatelj učinkovitog vezanja receptor-ligand, kao što je uočeno za ivermektin (dodatna slika S7), potvrđuje da 5-jodoindol i 2-jodoindol, poput ivermektina, čvrsto se veže za aktivno mjesto GluCL receptora preko leucina 218 (Slika 6 i Dodatna slika S8). Predlažemo da je ovo vezanje potrebno za održavanje otvorene strukture pora kompleksa GluCL i da se 5-jodoindolom, 2-jodoindolom, avermektinom i ivermektinom, čvrstim vezanjem na aktivno mjesto GluCL receptora, održava otvorenim ionski kanal i omogućuje unos tekućine.
Molekularno spajanje indola i halogeniranog indola na GluCL. Orijentacije vezanja (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola i (D) 5-jodoindola liganada na aktivno mjesto GluCL. Protein je predstavljen vrpcom, a glavne vodikove veze prikazane su žutim točkastim linijama. (A'), (B'), (C') i (D') pokazuju interakcije odgovarajućih liganada s okolnim aminokiselinskim ostacima, a vodikove veze bočnog lanca označene su ružičastim točkastim strelicama.
Provedeni su pokusi za procjenu toksičnog učinka 5-jodoindola na klijavost sjemena kupusa i rotkvice. 5-jodoindol (0,05 ili 0,1 mM) ili avermektin (10 μg/mL) imali su mali ili nikakav učinak na početno klijanje i nicanje biljčica (Slika 7). Osim toga, nije pronađena značajna razlika između stope klijavosti netretiranih kontrola i sjemena tretiranog s 5-jodoindolom ili avermektinom. Učinak na produljenje glavnog korijena i broj formiranih bočnih korijena bio je beznačajan, iako je 1 mM (10 puta njegova aktivna koncentracija) 5-jodoindola malo odgodio razvoj bočnih korijena. Ovi rezultati pokazuju da je 5-jodoindol netoksičan za biljne stanice i da ne ometa razvojne procese biljaka u ispitivanim koncentracijama.
Učinak 5-jodoindola na klijavost sjemena. Klijanje, nicanje i bočno ukorjenjivanje sjemena B. oleracea i R. raphanistrum na Murashige i Skoog agar podlozi sa ili bez avermektina ili 5-jodoindola. Klijanje je zabilježeno nakon 3 dana inkubacije na 22°C.
Ova studija prikazuje nekoliko slučajeva ubijanja nematoda indolima. Važno je napomenuti da je ovo prvo izvješće o metilaciji koja izaziva jodoindol (proces uzrokovan nakupljanjem malih vakuola koje se postupno stapaju u divovske vakuole, što na kraju dovodi do pucanja membrane i smrti) u borovim iglicama, pri čemu jodoindol pokazuje značajna nematicidna svojstva slična onima komercijalnog nematicida avermektina.
Prethodno je objavljeno da indoli vrše višestruke signalne funkcije kod prokariota i eukariota, uključujući inhibiciju/stvaranje biofilma, preživljavanje bakterija i patogenost19,32,33,34. Nedavno su potencijalni terapijski učinci halogeniranih indola, indolnih alkaloida i polusintetskih derivata indola privukli opsežan istraživački interes35,36,37. Na primjer, pokazalo se da halogenirani indoli ubijaju postojane stanice Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. Osim toga, od znanstvenog je interesa proučavati učinkovitost halogeniranih indola protiv drugih vrsta, rodova i kraljevstava, a ova je studija korak prema postizanju tog cilja.
Ovdje predlažemo mehanizam za smrtnost izazvanu 5-jodoindolom u C. elegans na temelju reverzibilne ozljede stanica (RCI) i metilacije (slike 4C i 5). Edematozne promjene poput natečenosti i vakuolarne degeneracije pokazatelji su RCI i metilacije, koje se očituju kao divovske vakuole u citoplazmi48,49. RCI ometa proizvodnju energije smanjenjem proizvodnje ATP-a, uzrokujući zatajenje pumpe ATPaze ili ometanje staničnih membrana i izazivanje brzog priljeva Na+, Ca2+ i vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastaju u životinjskim stanicama kao rezultat nakupljanja tekućine u citoplazmi zbog priljeva Ca2+ i vode53. Zanimljivo je da je ovaj mehanizam oštećenja stanica reverzibilan ako je oštećenje privremeno i stanice počnu proizvoditi ATP određeno vrijeme, ali ako oštećenje potraje ili se pogorša, stanice umiru.54 Naša opažanja pokazuju da nematode tretirane 5-jodoindolom ne mogu obnoviti normalnu biosintezu nakon izlaganja stresnim uvjetima.
Fenotip metilacije induciran 5-jodoindolom u B. xylophilus može biti posljedica prisutnosti joda i njegove molekularne distribucije, budući da je 7-jodoindol imao manji inhibicijski učinak na B. xylophilus od 5-jodoindola (tablica 1 i dodatna slika S6). Ovi rezultati su djelomično u skladu sa studijama Maltesea i sur. (2014.), koji su izvijestili da je translokacija piridilnog dušikovog dijela u indolu iz para- u meta-položaj ukinula vakuolizaciju, inhibiciju rasta i citotoksičnost u U251 stanicama, sugerirajući da je interakcija molekule sa specifičnim aktivnim mjestom u proteinu kritična27,44,45. Interakcije između indola ili halogeniranih indola i GluCL receptora promatrane u ovoj studiji također podupiru ovu ideju, jer je utvrđeno da se 5- i 2-jodoindol jače vežu na GluCL receptore od ostalih ispitanih indola (Slika 6 i Dodatna slika S8). Utvrđeno je da se jod na drugom ili petom položaju indola veže na leucin 218 GluCL receptora preko okosnice vodikovih veza, dok drugi halogenirani indoli i sam indol stvaraju slabe vodikove veze bočnog lanca sa serinom 260 (Slika 6). Stoga nagađamo da lokalizacija halogena igra važnu ulogu u indukciji vakuolarne degeneracije, dok čvrsto vezanje 5-jodoindola drži ionski kanal otvorenim, čime se omogućuje brzi dotok tekućine i pucanje vakuole. Međutim, detaljan mehanizam djelovanja 5-jodoindola tek treba utvrditi.
Prije praktične primjene 5-jodoindola potrebno je analizirati njegov toksični učinak na biljke. Naši pokusi klijanja sjemena pokazali su da 5-jodoindol nije imao negativan učinak na klijavost sjemena ili kasnije razvojne procese u proučavanim koncentracijama (Slika 7). Dakle, ovo istraživanje daje osnovu za korištenje 5-jodoindola u ekološkom okolišu za kontrolu štetnosti borovih nematoda na borove.
Prethodna izvješća pokazala su da terapija na bazi indola predstavlja potencijalni pristup rješavanju problema otpornosti na antibiotike i progresije raka55. Osim toga, indoli posjeduju antibakterijska, antikancerogena, antioksidativna, protuupalna, antidijabetička, antivirusna, antiproliferativna i antituberkulozna djelovanja te mogu poslužiti kao obećavajuća osnova za razvoj lijekova56,57. Ova studija prvi put sugerira potencijalnu upotrebu joda kao antiparazitskog i antihelmintskog sredstva.
Avermektin je otkriven prije tri desetljeća i dobio Nobelovu nagradu 2015. godine, a njegova upotreba kao lijeka protiv glista još uvijek je u tijeku. Međutim, zbog brzog razvoja otpornosti na avermektine kod nematoda i insekata štetnika, potrebna je alternativna, jeftina i ekološki prihvatljiva strategija za kontrolu infekcije borove kuge u borovima. Ova studija također prikazuje mehanizam kojim 5-jodoindol ubija borove nematode i da 5-jodoindol ima nisku toksičnost za biljne stanice, što otvara dobre izglede za njegovu buduću komercijalnu primjenu.
Sve pokuse odobrio je Etički odbor Sveučilišta Yeungnam, Gyeongsan, Koreja, a metode su provedene u skladu sa smjernicama Etičkog odbora Sveučilišta Yeungnam.
Pokusi inkubacije jaja provedeni su prema utvrđenim postupcima43. Za procjenu stope izlijeganja (HR), 1 dan stare odrasle nematode (otprilike 100 ženki i 100 mužjaka) prebačene su u Petrijeve zdjelice koje sadrže gljivicu i ostavljene da rastu 24 sata. Jaja su zatim izolirana i tretirana s 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) kao suspenzijom u sterilnoj destiliranoj vodi. Te su suspenzije (500 μl; približno 100 jaja) prebačene u jažice ploče za kulturu tkiva s 24 jažice i inkubirane na 22 °C. Brojanja L2 napravljena su nakon 24 sata inkubacije, ali su smatrane mrtvima ako se stanice nisu pomicale kada su stimulirane finom platinastom žicom. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinirani i prezentirani. Postotak HR-a izračunava se na sljedeći način:
Smrtnost ličinki procijenjena je pomoću prethodno razvijenih postupaka. Jaja nematoda su sakupljena, a embriji su sinkronizirani izleganjem u sterilnoj destiliranoj vodi kako bi se stvorile ličinke L2 stadija. Sinkronizirane ličinke (približno 500 nematoda) tretirane su 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) i uzgajane na Petrijevim pločama B. cinerea. Nakon 48 sati inkubacije na 22 °C, nematode su sakupljene u sterilnoj destiliranoj vodi i ispitane na prisutnost stadija L2, L3 i L4. Prisutnost stadija L3 i L4 ukazuje na transformaciju ličinke, dok prisutnost stadija L2 ukazuje na odsustvo transformacije. Slike su dobivene pomoću iRiS™ Digital Cell Imaging System. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinirani i prezentirani.
Toksičnost 5-jodoindola i avermektina na sjeme procijenjena je pomoću testova klijavosti na pločama s agarom Murashige i Skoog.62 Sjeme B. oleracea i R. raphanistrum najprije je namočeno u sterilnoj destiliranoj vodi jedan dan, isprano s 1 ml 100% etanola, sterilizirano s 1 ml 50% komercijalnog izbjeljivača (3% natrijev hipoklorit) 15 min, i ispere pet puta s 1 ml sterilne vode. Sterilizirano sjeme je zatim pritisnuto na ploče agara za klijanje koje sadrže 0,86 g/l (0,2X) Murashige i Skoog medija i 0,7% bakteriološkog agara sa ili bez 5-jodoindola ili avermektina. Ploče su zatim inkubirane na 22 °C, a slike su snimljene nakon 3 dana inkubacije. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, od kojih je svaka imala šest ponavljanja.
Vrijeme objave: 26. veljače-2025