Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koji koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje rezultate preporučujemo da koristite noviju verziju svog preglednika (ili onemogućite način rada kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Otkriće i korisna uporaba prirodnih proizvoda može poboljšati ljudski život.Kemikalije koje inhibiraju rast biljaka naširoko se koriste kao herbicidi za suzbijanje korova.Zbog potrebe korištenja različitih vrsta herbicida, javlja se potreba za identificiranjem spojeva s novim mehanizmima djelovanja.U ovoj smo studiji otkrili novi spoj N-alkoksipirola, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i uspostavili potpuni proces sinteze.Testovima biološke aktivnosti otkrili smo da je urs-monoaminska kiselina sintetski intermedijer urs-monoamida i potencijalniinhibitor rasta biljaka.Osim toga, razvili smo razne derivate urbenonske kiseline, uključujući derivat urbeniloksi (UDA), koji ima visoko herbicidno djelovanje bez negativnog utjecaja na rast HeLa stanica.Također smo otkrili da derivati urmotonične kiseline ometaju mikrotubule biljaka;osim toga, KAND utječe na aktinske filamente i inducira staničnu smrt;Ovi višestruki učinci razlikuju se od onih poznatih inhibitora mikrotubula i sugeriraju novi mehanizam djelovanja ursonske kiseline, što predstavlja važnu prednost u razvoju novih herbicida.
Otkriće i praktična primjena korisnih prirodnih proizvoda i njihovih derivata način je poboljšanja kvalitete ljudskog života.Sekundarni metaboliti koje proizvode mikroorganizmi, biljke i kukci doveli su do velikog napretka u medicini i poljoprivredi.Mnogi antibiotici i lijekovi protiv leukemije razvijeni su iz prirodnih proizvoda.Osim toga, razne vrstepesticida, fungicidi i herbicidi ekstrahiraju se iz ovih prirodnih proizvoda za upotrebu u poljoprivredi.Konkretno, herbicidi za suzbijanje korova važni su alati za povećanje prinosa usjeva u modernoj poljoprivredi, a razne vrste spojeva već se komercijalno koriste.Nekoliko staničnih procesa u biljkama, kao što su fotosinteza, metabolizam aminokiselina, sinteza stanične stijenke, regulacija mitoze, signalizacija fitohormona ili sinteza proteina, smatraju se tipičnim ciljevima herbicida.Spojevi koji inhibiraju funkciju mikrotubula uobičajena su klasa herbicida koji utječu na rast biljaka utječući na regulaciju mitoze2.
Mikrotubule su komponente citoskeleta i široko su očuvane u eukariotskim stanicama.Heterodimer tubulina sastoji se od α-tubulina i β-tubulina koji tvore linearne protofilamente mikrotubula, s 13 protofilamenata koji tvore cilindričnu strukturu.Mikrotubule imaju višestruke uloge u biljnim stanicama, uključujući određivanje oblika stanice, stanične diobe i unutarstaničnog transporta3,4.Biljne stanice sadrže mikrotubule ispod međufazne plazma membrane, a za te takozvane kortikalne mikrotubule se smatra da kontroliraju organizaciju celuloznih mikrofibrila kroz regulaciju kompleksa celulozne sintaze4,5.Kortikalni mikrotubuli epidermalnih stanica korijena, prisutni u zoni brzog izduživanja vrha korijena, smješteni su lateralno, a celulozna mikrovlakna prate te mikrotubule i ograničavaju smjer širenja stanica, čime potiču anizotropno izduživanje stanica.Stoga je funkcija mikrotubula usko povezana s morfologijom biljke.Supstitucije aminokiselina u genima koji kodiraju tubulin uzrokuju iskrivljenje nizova kortikalnih mikrotubula i rast lijevo ili desno u Arabidopsis 6,7.Slično tome, mutacije u proteinima povezanim s mikrotubulima koji reguliraju dinamiku mikrotubula također mogu dovesti do iskrivljenog rasta korijena8,9,10,11,12,13.Osim toga, tretiranje herbicidima koji ometaju mikrotubule kao što je dizopiramid, također poznat kao pretilaklor, također uzrokuje kosi rast korijena na lijevoj strani14.Ovi podaci pokazuju da je precizna regulacija funkcije mikrotubula ključna za određivanje smjera rasta biljke.
Otkrivene su različite vrste inhibitora mikrotubula, a ti su lijekovi dali značajan doprinos istraživanju citoskeleta, kao i poljoprivredi i medicini2.Konkretno, orizalin, spojevi dinitroanilina, dizopiramid, spojevi slični benzamidu i njihovi analozi mogu inhibirati funkciju mikrotubula i time inhibirati rast biljaka.Stoga se naširoko koriste kao herbicidi.Međutim, budući da su mikrotubule važna komponenta biljnih i životinjskih stanica, većina inhibitora mikrotubula je citotoksična za obje vrste stanica.Stoga, unatoč njihovoj priznatoj korisnosti kao herbicida, ograničeni broj sredstava protiv mikrotubula koristi se u praktične svrhe.
Streptomyces je rod iz obitelji Streptomyces, koji uključuje aerobne, gram-pozitivne, filamentozne bakterije i nadaleko je poznat po svojoj sposobnosti proizvodnje širokog spektra sekundarnih metabolita.Stoga se smatra jednim od najvažnijih izvora novih biološki aktivnih prirodnih proizvoda.U trenutnoj studiji otkrili smo novi spoj nazvan kumamonamid, koji je izoliran iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Korištenjem spektralne analize i potpune spektralne analize, karakterizirana je struktura kumamonamida i njegov jedinstveni kostur N-alkoksipirola bio određen.sinteza.Ursmonska kiselina, sintetski intermedijer ursmonoamida i njegovih derivata, inhibira rast i klijanje popularne model biljke Arabidopsis thaliana.U studiji odnosa strukture i aktivnosti, otkrili smo da spoj s C9 modificiranim u ursonsku kiselinu, nazvan noniloksi derivat ursonske kiseline (KAND), značajno pojačava inhibitorni učinak na rast i klijanje.Naime, novootkriveni inhibitor rasta biljaka također je utjecao na rast duhana i jetrenjače te nije bio citotoksičan za bakterije ili HeLa stanice.Štoviše, neki derivati urmotonske kiseline induciraju iskrivljeni fenotip korijena, što implicira da ti derivati izravno ili neizravno utječu na mikrotubule.U skladu s ovom idejom, naša opažanja mikrotubula obilježenih ili imunohistokemijski ili fluorescentnim proteinima pokazuju da KAND tretman depolimerizira mikrotubule.Osim toga, liječenje derivatima kumamotonske kiseline poremetilo je mikrofilamente aktina.Tako smo otkrili novi inhibitor rasta biljaka čiji jedinstveni mehanizam djelovanja uključuje razaranje citoskeleta.
Soj MK493-CF1 izoliran je iz tla u Shinagawa-kuu u Tokiju.Soj MK493-CF1 formirao je dobro razgranati stromalni micelij.Određen je djelomični slijed gena 16S ribosomske RNA (1422 bp).Ovaj je soj vrlo sličan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipični soj, 99,93%).Na temelju ovog rezultata utvrđeno je da je ovaj soj usko povezan s tipskim sojem S. werraensis.Stoga smo ovaj soj privremeno nazvali S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T također proizvodi iste bioaktivne spojeve.Budući da je bilo malo ranih istraživanja dobivanja prirodnih proizvoda iz ovog mikroorganizma, provedena su daljnja kemijska istraživanja.Nakon uzgoja S. werraensis MK493-CF1 na mediju ječma fermentacijom u čvrstom stanju na 30°C tijekom 14 dana, medij je ekstrahiran s 50% EtOH.60 ml uzorka se osuši da se dobije 59,5 mg sirovog ekstrakta.Sirovi ekstrakt je podvrgnut HPLC-u reverzne faze da se dobije N-metoksi-lH-pirol-2-karboksamid (1, nazvan kumamonamid, 36,0 mg).Ukupna količina 1 je približno 60% sirovog ekstrakta.Stoga smo odlučili detaljno proučiti svojstva kumamotoamida 1.
Coumamonamide 1 je bijeli amorfni prah i masena spektrometrija visoke rezolucije (HRESIMS) potvrđuje C6H8N2O2 (slika 1).C2-supstituirani pirolski fragment ovog spoja karakterizira δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH u 1H NMR spektru: 4,5 Hz , H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a 13C NMR spektar pokazuje prisutnost četiri sp2 atoma ugljika.Prisutnost amidne skupine na položaju C2 procijenjena je HMBC korelacijom od C-3 protona do amidnog karbonilnog ugljika na δC 161,1.Dodatno, 1H i 13C NMR vršci na δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 ukazuju na prisutnost N-metoksi skupina u molekuli.Iako točan položaj metoksi skupine još nije bio određen korištenjem spektroskopske analize kao što je spektroskopija poboljšane razlike i nuklearna Overhauserova kratica (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid je postao prvi spoj kandidat.
Da bi se odredila točna struktura 1, izvršena je potpuna sinteza (Sl. 2a).Obrada komercijalno dostupnog 2-aminopiridina 2 s m-CPBA rezultirala je odgovarajućim N-oksidom 3 u kvantitativnom prinosu.Nakon 2-aminoazidacije 2, reakcija ciklokondenzacije koju je opisao Abramovich provedena je u benzenu na 90°C da se dobije željeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 u gramima.Brzina 60% (dva stupnja).15,16.Metilacija i hidroliza 4 zatim daju 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (nazvanu "kumotonska kiselina", 6) u dobrom prinosu (70%, dva koraka).Konačno, amidacija preko kiselinskog klorida međuprodukta 6 korištenjem vodene otopine amonijaka dala je Kumamoto amid 1 u prinosu od 98%.Svi spektralni podaci sintetiziranog 1 bili su slični izoliranom 1, tako da je određena struktura 1;
Opća sinteza i analiza biološke aktivnosti urbenamida i urbenske kiseline.(a) Potpuna sinteza Kumamoto amida.(b) Sadnice divljeg tipa Arabidopsis Columbia (Col) stare sedam dana uzgojene su na Murashige i Skoog (MS) pločama koje sadrže kumamonamid 6 ili kumamonamid 1 u navedenim koncentracijama.Mjerna traka = 1 cm.
Prvo smo procijenili biološke aktivnosti urbenamida i njegovih intermedijera u pogledu njihove sposobnosti moduliranja rasta biljaka.Dodali smo različite koncentracije ursmonamida 1 ili ursmonske kiseline 6 u MS agar medij i uzgojili sadnice Arabidopsis thaliana na ovom mediju.Ovi testovi su pokazali da visoke koncentracije (500 μM) 6 inhibiraju rast korijena (slika 2b).Zatim smo generirali različite derivate zamjenom N1 položaja od 6 i proveli studije odnosa strukture i aktivnosti na njima (proces analogne sinteze opisan je u Popratnim informacijama (SI)).Sadnice Arabidopsis uzgojene su na mediju s 50 µM derivata ursonske kiseline te je mjerena duljina korijena.kako je prikazano na slici.Kao što je prikazano na slikama 3a, b i S1, kumamo kiseline imaju različite duljine linearnih alkoksi lanaca (9, 10, 11, 12 i 13) ili velikih alkoksi lanaca (15, 16 i 17) na položaju N1.Derivati su pokazali značajnu inhibiciju rasta korijena.Osim toga, otkrili smo da primjena 200 μM 10, 11 ili 17 inhibira klijanje (slike 3c i S2).
Proučavanje odnosa strukture i aktivnosti Kumamoto amida i srodnih spojeva.(a) Struktura i shema sinteze analoga.(b) Kvantifikacija duljine korijena 7 dana starih klijanaca uzgojenih na MS mediju sa ili bez 50 μM derivata kumamonamida.Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažno liječenje (t test, str< 0,05).n>18. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.nt znači "nije testirano" jer više od 50% sjemena nije proklijalo.(c) Kvantifikacija brzine klijanja tretiranog sjemena inkubiranog 7 dana u MS mediju sa ili bez 200 μM kumamonamida i srodnih spojeva.Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažno liječenje (hi-kvadrat test).n=96.
Zanimljivo je da je dodatak alkilnih bočnih lanaca duljih od C9 smanjio inhibitornu aktivnost, što sugerira da spojevi povezani s kumamotoičnom kiselinom zahtijevaju bočne lance određene veličine da bi pokazali svoju biološku aktivnost.
Budući da je analiza odnosa strukture i aktivnosti pokazala da je C9 modificiran u ursonsku kiselinu i da je noniloksi derivat ursonske kiseline (u daljnjem tekstu KAND 11) najučinkovitiji inhibitor rasta biljaka, proveli smo detaljniju karakterizaciju KAND 11. Liječenje Arabidopsis s 50 μM KAND 11 gotovo je potpuno spriječio klijanje, dok su niže koncentracije (40, 30, 20 ili 10 μM) KAND 11 inhibirale rast korijena na način ovisan o dozi (Slika 4a, b).Kako bismo testirali utječe li KAND 11 na održivost korijenskog meristema, ispitali smo korijenske meristeme obojene propidijevim jodidom (PI) i izmjerili veličinu površine meristema.Veličina meristema presadnica uzgojenih na podlozi s 25 µM KAND-11 bila je 151,1 ± 32,5 µm, dok je veličina meristema presadnica uzgojenih na kontrolnoj podlozi s DMSO bila 264,7 ± 30,8 µm (Sl. 4c, d) , što ukazuje da KAND-11 obnavlja staničnu aktivnost.širenje.Meristem korijena.U skladu s ovim, tretman KAND 11 smanjio je količinu signala markera stanične diobe CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS u korijenskom meristemu (Slika 4e) 17 .Ovi rezultati pokazuju da KAND 11 inhibira rast korijena smanjenjem aktivnosti proliferacije stanica.
Analiza inhibicijskog učinka derivata urbenonske kiseline (urbeniloksi derivata) na rast.(a) 7 dana stare sadnice divljeg tipa Col uzgojene na MS pločama s naznačenim koncentracijama KAND 11. Mjerna traka = 1 cm.(b) Kvantifikacija duljine korijena.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).n>16. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.(c) Konfokalna mikroskopija propidijevim jodidom obojenih korijena Col divljeg tipa uzgojenih na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11. Bijele zagrade označavaju korijenski meristem.Mjerna traka = 100 µm.(d) Kvantifikacija veličine korijenskog meristema (n = 10 do 11).Statističke razlike određene su t-testom (str< 0,05).Stupci predstavljaju prosječnu veličinu meristema.(e) Mikroskopija diferencijalnog interferencijskog kontrasta (DIC) meristema korijena koji sadrži konstrukt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS obojen i obojen na 5 dana starim sadnicama uzgojenim na MS pločama sa ili bez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND-a 11 dodatno je ispitana korištenjem druge dikotilne biljke, duhana (Nicotiana tabacum), i glavnog modela organizma kopnene biljke, jetrenjače (Marchantia polymorpha).Kao iu slučaju Arabidopsis, sadnice duhana SR-1 uzgojene na podlozi s 25 µM KAND 11 dale su kraće korijenje (slika 5a).Dodatno, 40 od 48 sjemenki proklijalo je na pločama koje sadrže 200 µM KAND 11, dok je svih 48 sjemenki proklijalo na lažno tretiranom mediju, što ukazuje da su veće koncentracije KAND-a bile značajne (p< 0,05;chi test -kvadrat) inhibirao je klijanje duhana.(Slika 5b).Osim toga, koncentracija KAND-a 11 koja je inhibirala rast bakterija u jetrenjaci bila je slična učinkovitoj koncentraciji u Arabidopsisu (slika 5c).Ovi rezultati pokazuju da KAND 11 može inhibirati rast raznih biljaka.Zatim smo istražili moguću citotoksičnost spojeva povezanih s medvjeđim monoamidom u drugim organizmima, točnije ljudskim HeLa stanicama i soju Escherichia coli DH5α, kao predstavnicima viših životinjskih i bakterijskih stanica.U nizu testova stanične proliferacije, primijetili smo da kumamonamid 1, kumamonamidna kiselina 6 i KAND 11 nisu utjecali na rast stanica HeLa ili E. coli u koncentracijama od 100 μM (Slika 5d,e).
Inhibicija rasta KAND 11 u organizmima koji nisu Arabidopsis.(a) Dva tjedna stare presadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na okomito postavljenim MS pločama koje sadrže 25 μM KAND 11. (b) Presadnice duhana divljeg tipa SR-1 stare dva tjedna uzgajane su na vodoravno postavljenim presadnicama MS ploče koje sadrže 200 µM KAND 11. (c) Dva tjedna stari pupoljci jetrenke Tak-1 divljeg tipa uzgojeni na Gamborg B5 pločama s naznačenim koncentracijama KAND 11. Crvene strelice označavaju spore koje su prestale rasti unutar dvotjedne inkubacije razdoblje.(d) Test stanične proliferacije HeLa stanica.Broj živih stanica mjeren je u fiksnim vremenskim intervalima korištenjem kompleta za brojanje stanica 8 (Dojindo).Kao kontrola HeLa stanice tretirane su s 5 μg/ml aktinomicina D (Act D), koji inhibira transkripciju RNA polimeraze i uzrokuje smrt stanice.Analize su provedene u tri primjerka.(e) Test proliferacije stanica E. coli.Rast E. coli analiziran je mjerenjem OD600.Kao kontrola, stanice su tretirane s 50 μg/ml ampicilina (Amp), koji inhibira sintezu bakterijske stanične stijenke.Analize su provedene u tri primjerka.
Kako bismo dešifrirali mehanizam djelovanja citotoksičnosti uzrokovane uramidima srodnim spojevima, ponovno smo analizirali derivate urbenske kiseline s umjerenim inhibicijskim učincima.kako je prikazano na slici.Kao što je prikazano na slikama 2b, 6a, sadnice uzgojene na agar pločama koje sadrže visoke koncentracije (200 μM) urmotonske kiseline 6 dale su kraće i lijevo zakrivljene korijene (θ = – 23,7 ± 6,1), dok su sadnice uzgojene na kontrolnom mediju, sadnice su pustile gotovo ravno korijenje (θ = – 3,8 ± 7,1).Poznato je da je ovaj karakterističan kosi rast posljedica disfunkcije kortikalnih mikrotubula14,18.U skladu s ovim nalazom, lijekovi za destabilizaciju mikrotubula dizopiramid i orizalin inducirali su slično naginjanje korijena u našim uvjetima rasta (Slike 2b, 6a).Istodobno smo testirali derivate urmotonske kiseline i odabrali nekoliko njih koji su u određenim koncentracijama potaknuli kosi rast korijena.Spojevi 8, 9 i 15 promijenili su smjer rasta korijena pri 75 μM, 50 μM, odnosno 40 μM, što ukazuje da ovi spojevi mogu učinkovito destabilizirati mikrotubule (Slika 2b, 6a).Također smo testirali najjači derivat ursolne kiseline, KAND 11, u nižoj koncentraciji (15 µM) i otkrili da primjena KAND-a 11 inhibira rast korijena i da je smjer rasta korijena neravnomjeran, iako su imali tendenciju nagiba ulijevo ( Slika C3)..Budući da veće koncentracije lijekova koji destabiliziraju mikrotubule ponekad inhibiraju rast biljaka umjesto da uzrokuju naginjanje korijena, naknadno smo procijenili mogućnost da KAND 11 utječe na mikrotubule promatrajući kortikalne mikrotubule u epidermalnim stanicama korijena.Imunohistokemija korištenjem anti-β-tubulinskih protutijela u epidermalnim stanicama korijena klijanaca tretiranih s 25 µM KAND 11 pokazala je nestanak gotovo svih kortikalnih mikrotubula u epidermalnim stanicama u zoni elongacije (slika 6b).Ovi rezultati pokazuju da kumamotonska kiselina i njezini derivati djeluju izravno ili neizravno na mikrotubule da ih ometaju i da su ti spojevi novi inhibitori mikrotubula.
Ursonska kiselina i njezini derivati mijenjaju kortikalne mikrotubule u Arabidopsis thaliana.(a) Kut nagiba korijena izmjeren u prisutnosti različitih derivata urmotonske kiseline u navedenim koncentracijama.Analizirani su i učinci dvaju spojeva za koje je poznato da inhibiraju mikrotubule: disopiramida i orizalina.Umetak prikazuje standard koji se koristi za mjerenje kuta rasta korijena.Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažno liječenje (t test, str< 0,05).n>19. Mjerilo = 1 cm.(b) Kortikalni mikrotubuli u epidermalnim stanicama u zoni elongacije.Mikrotubule u korijenima divljeg tipa Arabidopsis Col uzgojene na MS pločama sa ili bez 25 µM KAND 11 vizualizirane su imunohistokemijskim bojanjem upotrebom primarnih protutijela β-tubulina i sekundarnih protutijela konjugiranih Alexa Fluor.Mjerna traka = 10 µm.(c) Mitotička struktura mikrotubula u korijenskom meristemu.Mikrotubule su vizualizirane pomoću imunohistokemijskog bojenja.Mitotičke strukture, uključujući profazne zone, vretena i fragmoplaste, izbrojane su iz konfokalnih slika.Strelice pokazuju strukture mitotičkih mikrotubula.Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažno liječenje (t test, str< 0,05).n>9. Mjerna traka = 50 µm.
Iako Ursa ima sposobnost poremetiti funkciju mikrotubula, očekuje se da će se njegov mehanizam djelovanja razlikovati od tipičnih sredstava za depolimerizaciju mikrotubula.Na primjer, veće koncentracije sredstava za depolimerizaciju mikrotubula kao što su dizopiramid i orizalin induciraju anizotropno širenje epidermalnih stanica, dok KAND 11 to ne čini.Osim toga, ko-primjena KAND-a 11 i dizopiramida rezultirala je kombiniranim disopiramidom-induciranim odgovorom rasta korijena i uočena je inhibicija rasta izazvana KAND-om 11 (slika S4).Također smo analizirali odgovor preosjetljivog disopiramida 1-1 (phs1-1) mutanta na KAND 11. phs1-1 ima nekanoničku točkastu mutaciju tubulin kinaze i proizvodi kraće korijene kada se tretira disopiramidom9,20.phs1-1 mutirane sadnice uzgojene na agar mediju koji je sadržavao KAND 11 imale su kraće korijene slične onima uzgojenim na dizopiramidi (sl. S5).
Osim toga, promatrali smo strukture mitotičkih mikrotubula, kao što su profazne zone, vretena i fragmoplasti, u korijenskom meristemu sadnica tretiranih s KAND 11. U skladu s opažanjima za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, značajno smanjenje u promatran je broj mitotskih mikrotubula (slika .6c).
Kako bismo karakterizirali citotoksičnost KAND-a 11 pri substaničnoj rezoluciji, tretirali smo stanice duhanske suspenzije BY-2 s KAND-om 11 i promatrali njihov odgovor.Prvo smo dodali KAND 11 stanicama BY-2 koje izražavaju TagRFP-TUA6, koji fluorescentno označava mikrotubule, kako bismo procijenili učinak KAND-a 11 na kortikalne mikrotubule.Gustoća kortikalnih mikrotubula procijenjena je pomoću analize slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletalnih piksela među citoplazmatskim pikselima.Rezultati ispitivanja su pokazali da se nakon tretmana s 50 μM ili 100 μM KAND 11 tijekom 1 sata, gustoća značajno smanjila na 0,94 ± 0,74% odnosno 0,23 ± 0,28%, dok je gustoća stanica tretiranih s DMSO iznosila 1,61 ± 0,34 % (slika 7a).Ovi rezultati su u skladu s opažanjem u Arabidopsis da liječenje KAND 11 inducira depolimerizaciju kortikalnih mikrotubula (slika 6b).Također smo ispitali liniju BY-2 s GFP-ABD-obilježenim aktin filamentima nakon tretmana s istom koncentracijom KAND 11 i uočili da je tretman KAND 11 poremetio aktinske filamente.Tretman s 50 µM ili 100 µM KAND 11 tijekom 1 sata značajno je smanjio gustoću aktin filamenta na 1,20 ± 0,62% odnosno 0,61 ± 0,26%, respektivno, dok je gustoća u stanicama tretiranim DMSO-om bila 1,69 ± 0,51% (slika 2).7b).Ovi rezultati su u suprotnosti s učincima propizamida, koji ne utječe na aktinske filamente, i latrunculina B, depolimerizatora aktina koji ne utječe na mikrotubule (SI Slika S6).Osim toga, liječenje kumamonamidom 1, kumamonamidnom kiselinom 6 ili KAND 11 nije utjecalo na mikrotubule u HeLa stanicama (SI slika S7).Stoga se vjeruje da se mehanizam djelovanja KAND-a 11 razlikuje od mehanizma poznatih disruptora citoskeleta.Osim toga, naše mikroskopsko promatranje stanica BY-2 tretiranih s KAND-om 11 otkrilo je početak stanične smrti tijekom tretmana s KAND-om 11 i pokazalo da se udio Evans plavo obojenih mrtvih stanica nije značajno povećao nakon 30 minuta tretmana s KAND-om 11, dok nakon 90 minuta tretmana s 50 µM ili 100 µM KAND-a, broj mrtvih stanica porastao je na 43,7% odnosno 80,1%, respektivno (slika 7c).Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da je novi derivat ursolne kiseline KAND 11 citoskeletni inhibitor specifičan za biljke s dosad nepoznatim mehanizmom djelovanja.
KAND utječe na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente i održivost BY-2 stanica duhana.(a) Vizualizacija kortikalnih mikrotubula u BY-2 stanicama u prisutnosti TagRFP-TUA6.BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom.Gustoća kortikalnih mikrotubula izračunata je iz mikrofotografija 25 neovisnih stanica.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Mjerna traka = 10 µm.(b) Kortikalni aktinski filamenti u BY-2 stanicama vizualizirani u prisutnosti GFP-ABD2.BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom.Gustoća kortikalnih aktinskih filamenata izračunata je iz mikrofotografija 25 neovisnih stanica.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Mjerna traka = 10 µm.(c) Promatranje mrtvih BY-2 stanica bojanjem Evans plavim.BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su mikroskopijom svijetlog polja.n=3.Mjerna traka = 100 µm.
Otkriće i primjena novih prirodnih proizvoda doveli su do značajnog napretka u raznim aspektima ljudskog života, uključujući medicinu i poljoprivredu.Provedena su povijesna istraživanja kako bi se iz prirodnih izvora dobili korisni spojevi.Konkretno, poznato je da su aktinomicete korisne kao antiparazitski antibiotici za nematode zbog njihove sposobnosti da proizvode različite sekundarne metabolite kao što je avermektin, vodeći spoj ivermektina i bleomicina i njegovih derivata, koji se koriste u medicini kao antikancerogeno sredstvo21,22.Isto tako, različiti herbicidni spojevi otkriveni su iz aktinomiceta, od kojih se neki već koriste u komercijalne svrhe1,23.Stoga se analiza metabolita aktinomiceta za izolaciju prirodnih proizvoda sa željenim biološkim aktivnostima smatra učinkovitom strategijom.U ovoj studiji otkrili smo novi spoj, kumamonamid, iz S. werraensis i uspješno ga sintetizirali.Ursonska kiselina je sintetski intermedijer urbenamida i njegovih derivata.Može uzrokovati karakteristično uvijanje korijena, pokazivati umjereno do jako herbicidno djelovanje i izravno ili neizravno oštetiti mikrotubule biljaka.Međutim, mehanizam djelovanja urmotonske kiseline može se razlikovati od onog postojećih inhibitora mikrotubula, budući da KAND 11 također remeti aktinske filamente i uzrokuje staničnu smrt, što ukazuje na regulatorni mehanizam kojim urmotonična kiselina i njezini derivati utječu na širok raspon citoskeletnih struktura..
Daljnja detaljna karakterizacija urbenonske kiseline pomoći će boljem razumijevanju mehanizma djelovanja urbenonske kiseline.Konkretno, sljedeći cilj je procijeniti sposobnost ursonske kiseline da se veže na reducirane mikrotubule kako bi se utvrdilo djeluju li ursonska kiselina i njezini derivati izravno na mikrotubule i depolimeriziraju ih ili njihovo djelovanje dovodi do destabilizacije mikrotubula.Osim toga, u slučaju kada mikrotubule nisu izravna meta, identificiranje mjesta djelovanja i molekularnih ciljeva ursonske kiseline na biljnim stanicama pomoći će u daljnjem razumijevanju svojstava srodnih spojeva i mogućih načina za poboljšanje herbicidnog djelovanja.Naš test bioaktivnosti otkrio je jedinstvenu citotoksičnu sposobnost ursonske kiseline na rast biljaka kao što su Arabidopsis thaliana, duhan i jetrenka, dok niti E. coli niti HeLa stanice nisu bile pogođene.Mala ili nikakva toksičnost za životinjske stanice prednost je derivata ursonske kiseline ako se razvijaju kao herbicidi za upotrebu na otvorenim poljoprivrednim poljima.Doista, budući da su mikrotubule uobičajene strukture u eukariota, njihova selektivna inhibicija u biljkama ključni je zahtjev za herbicide.Na primjer, propyzamid, sredstvo za depolimerizaciju mikrotubula koje se izravno veže na tubulin i inhibira polimerizaciju, koristi se kao herbicid zbog svoje niske toksičnosti za životinjske stanice24.Za razliku od dizopiramida, srodni benzamidi imaju različite ciljane specifičnosti.Osim biljnih mikrotubula, RH-4032 ili benzoksamid također inhibira mikrotubule životinjskih stanica odnosno oomiceta, a zalilamid se koristi kao fungicid zbog niske fitotoksičnosti25,26,27.Novootkriveni medvjed i njegovi derivati pokazuju selektivnu citotoksičnost protiv biljaka, ali vrijedi napomenuti da daljnje modifikacije mogu promijeniti njihovu ciljanu specifičnost, potencijalno pružajući dodatne derivate za kontrolu patogenih gljiva ili oomiceta.
Jedinstvena svojstva urbenonske kiseline i njezinih derivata korisna su za njihov razvoj kao herbicida i korištenje kao alata za istraživanje.Opće je poznata važnost citoskeleta u kontroli oblika biljnih stanica.Ranije studije pokazale su da su biljke razvile složene mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula kontrolirajući dinamiku mikrotubula kako bi pravilno kontrolirale morfogenezu.Identificiran je velik broj molekula odgovornih za regulaciju aktivnosti mikrotubula, a srodna istraživanja još su u tijeku3,4,28.Naše trenutno razumijevanje dinamike mikrotubula u biljnim stanicama ne objašnjava u potpunosti mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula.Na primjer, iako i disopiramid i orizalin mogu depolimerizirati mikrotubule, disopiramid uzrokuje ozbiljno iskrivljenje korijena dok orizalin ima relativno blag učinak.Štoviše, mutacije u tubulinu, koji stabilizira mikrotubule, također uzrokuju dekstrorotaciju korijena, dok paklitaksel, koji također stabilizira dinamiku mikrotubula, ne uzrokuje.Stoga bi proučavanje i identificiranje molekularnih ciljeva ursolne kiseline trebalo pružiti nove uvide u regulaciju kortikalnih mikrotubula biljaka.Isto tako, buduće usporedbe kemikalija koje su učinkovite u poticanju iskrivljenog rasta, poput disopiramida, i manje učinkovitih kemikalija, poput orizalina ili kumamotorne kiseline, pružit će naznake kako dolazi do iskrivljenog rasta.
S druge strane, preustroji citoskeleta povezani s obranom još su jedna mogućnost objašnjenja citotoksičnosti ursonske kiseline.Infekcija patogenom ili uvođenje elicitora u biljne stanice ponekad uzrokuje uništenje citoskeleta i naknadnu smrt stanice29.Na primjer, objavljeno je da kriptoksantin dobiven iz oomiceta remeti mikrotubule i aktinske filamente prije smrti duhanskih stanica, slično onome što se događa kod liječenja KAND-om30,31.Sličnosti između obrambenih odgovora i staničnih odgovora induciranih ursonskom kiselinom dovele su nas do hipoteze da oni pokreću uobičajene stanične procese, iako je evidentan brži i jači učinak ursonske kiseline od kriptoksantina.Međutim, studije su pokazale da prekid aktinskih filamenata potiče spontanu staničnu smrt, što nije uvijek popraćeno prekidom mikrotubula29.Osim toga, ostaje za vidjeti uzrokuje li ili patogen ili elicitor poremećen rast korijena, kao što to čine derivati ursonske kiseline.Stoga je molekularno znanje koje povezuje obrambene reakcije i citoskelet privlačan problem kojim se treba pozabaviti.Iskorištavanjem prisutnosti spojeva niske molekularne težine povezanih s ursonskom kiselinom, kao i nizom derivata s različitim potencijama, mogu pružiti mogućnosti za ciljanje nepoznatih staničnih mehanizama.
Uzevši zajedno, otkriće i primjena novih spojeva koji moduliraju dinamiku mikrotubula pružit će snažne metode za rješavanje složenih molekularnih mehanizama koji leže u osnovi određivanja oblika biljnih stanica.U tom kontekstu, nedavno razvijeni spoj urmotonična kiselina, koji utječe na mikrotubule i aktinske filamente i inducira staničnu smrt, može pružiti priliku za dešifriranje veze između kontrole mikrotubula i ovih drugih mehanizama.Stoga će nam kemijska i biološka analiza pomoću urbenonske kiseline pomoći razumjeti molekularne regulacijske mehanizme koji kontroliraju citoskelet biljke.
Inokulirajte S. werraensis MK493-CF1 u Erlenmeyerovu tikvicu od 500 mL koja sadrži 110 mL medija za zasijavanje koji se sastoji od 2% (w/v) galaktoze, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto sastava .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrakt kukuruza (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 u deioniziranoj vodi.(pH 7,4 prije sterilizacije).Kulture sjemena su inkubirane na rotacijskoj tresilici (180 okretaja u minuti) na 27°C tijekom 2 dana.Uzgoj proizvodnje putem fermentacije u čvrstom stanju.Kultura sjemena (7 ml) prebačena je u K-1 tikvicu od 500 ml koja sadrži 40 g proizvodnog medija koji se sastoji od 15 g prešanog ječma (MUSO Co., Ltd., Japan) i 25 g deionizirane vode (pH nije prilagođen prije sterilizacije).).Fermentacija je provedena na 30°C u mraku 14 dana.Fermentacijski materijal ekstrahiran je s 40 ml/boci EtOH i centrifugiran (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatant kulture (60 ml) ekstrahiran je smjesom 10% MeOH/EtOAc.Organski sloj je isparen pod sniženim tlakom kako bi se dobio ostatak (59,5 mg), koji je podvrgnut HPLC-u s gradijentnom elucijom (0-10 minuta: 90%) na stupcu reverzne faze (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × duljina 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minuta: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradijent), 35-45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuta: 90% H2O /EtOH do 100% EtOH (gradijent (gradijent), 155–200 min: 100% EtOH) pri brzini protoka od 1,5 ml/min, izoliran je kumamonamid (1, 36,0 mg) kao bijeli amorfni prah.
kumamotoamid (1);'H-NMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, IH), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz IH), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunata vrijednost: 141,0659, izmjerena vrijednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Sjeme Columbia (Col-0) dobiveno je od Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) uz dopuštenje za istraživačku uporabu.Sjeme Col-0 razmnoženo je i održavano u našim laboratorijskim uvjetima i korišteno kao divlji tip biljaka Arabidopsis.Sjeme Arabidopsis je površinski sterilizirano i uzgajano u Murashige i Skoog mediju polovične jačine koji sadrži 2% saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) i 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, na 23 °C i stalnom svjetlu.Sjeme mutanta phs1-1 osigurao je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sjeme soja SR-1 osigurao je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) i korišteno je kao biljke divljeg tipa duhana.Sjemenke duhana površinski su sterilizirane i natopljene u sterilnoj vodi tri noći kako bi se pospješilo klijanje, zatim stavljene u polujaku otopinu koja sadrži 2% saharoze, 0,05% (w/v) MES i 0,8% gelan gume (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.i Skoog medij) s pH 5,7 i inkubiran na 23°C pod stalnim svjetlom.
Soj Tak-1 osigurao je T. Kohchi (Kyoto University) i korišten je kao standardna eksperimentalna jedinica za proučavanje jetrenjaka.Gemma je dobivena iz steriliziranih uzgojenih biljaka, a zatim je posađena na medij Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) koji je sadržavao 1% saharoze i 0,3% gelan gume i inkubirana na 23°C pod kontinuiranim svjetlom.
Duhanske BY-2 stanice (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) osigurao je S. Hasezawa (Sveučilište u Tokiju).BY-2 stanice su razrijeđene 95 puta u modificiranom Linsmeier i Skoog mediju i tjedno su im dodane 2,4-diklorfenoksioctene kiseline 32 .Stanična suspenzija miješana je na rotacijskoj tresilici pri 130 okretaja u minuti pri 27°C u mraku.Isperite stanice s 10 puta većim volumenom svježeg medija i resuspendirajte u istom mediju.BY-2 transgene stanične linije koje stabilno izražavaju marker mikrotubula TagRFP-TUA6 ili marker aktinskog filamenta GFP-ABD2 pod promotorom 35S virusa mozaika cvjetače stvorene su kako je opisano33,34,35.Ove stanične linije mogu se održavati i sinkronizirati korištenjem postupaka sličnih onima korištenim za izvornu staničnu liniju BY-2.
HeLa stanice su uzgajane u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Life Technologies) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 1,2 U/ml penicilina i 1,2 μg/ml streptomicina u inkubatoru na 37°C s 5% CO2.
Svi eksperimenti opisani u ovom rukopisu izvedeni su u skladu s japanskim propisima i smjernicama o biološkoj sigurnosti.
Spojevi su otopljeni u dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kao osnovne otopine i razrijeđeni u MS mediju za Arabidopsis i duhan ili Gamborg B5 mediju za jetrenjaču.Za ispitivanje inhibicije rasta korijena, više od 10 sjemenki po ploči je posijano na agar medij koji sadrži navedene spojeve ili DMSO.Sjeme je inkubirano u komori za rast 7 dana.Sadnice su fotografirane i izmjerena je duljina korijena.Za ispitivanje klijavosti Arabidopsis, 48 sjemenki po ploči je posijano na agar medij koji sadrži 200 µM spoja ili DMSO.Sjeme Arabidopsis uzgojeno je u komori za rast i broj proklijalih klijanaca izbrojan je 7 dana nakon klijanja (dag).Za ispitivanje klijavosti duhana, 24 sjemenke po ploči su posijane na agar medij koji sadrži 200 µM KAND ili DMSO.Sjeme duhana je uzgajano u komori za rast, a broj proklijalih klijanaca izbrojan je nakon 14 dana.Za test inhibicije rasta jetrenice, 9 embrija sa svake ploče je postavljeno na agar medij koji je sadržavao naznačene koncentracije KAND ili DMSO i inkubirano u komori za rast 14 dana.
Upotrijebite sadnice obojene s 5 mg/ml propidijevog jodida (PI) za vizualizaciju organizacije korijenskog meristema.PI signali promatrani su fluorescentnom mikroskopijom pomoću TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems).
Histokemijsko bojenje korijena β-glukuronidazom (GUS) provedeno je prema protokolu koji su opisali Malami i Benfey36.Presadnice su fiksirane u 90% acetonu preko noći, obojene s 0,5 mg/ml 5-brom-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronske kiseline u GUS puferu tijekom 1 sata i stavljene u hidratiziranu otopinu kloraldehida.(8 g kloralhidrata, 2 ml vode i 1 ml glicerola) i promatrano diferencijalnom interferencijskom kontrastnom mikroskopijom korištenjem mikroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kutovi korijena mjereni su na sadnicama starim 7 dana uzgojenim na okomito postavljenim pločama.Izmjerite kut korijena iz smjera vektora gravitacije kao što je opisano u koraku 6.
Raspored kortikalnih mikrotubula promatran je kako je opisano, uz manje izmjene protokola 37 .Anti-β-tubulinska antitijela (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i Alexa Fluor 488-konjugirani anti-mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) korištena su kao primarna i sekundarna antitijela u razrjeđenjima 1:1000 i 1:100, odnosno.Fluorescencijske slike dobivene su pomoću TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems).Prikupite Z-stack slike i stvorite projekcije maksimalnog intenziteta prema uputama proizvođača.
Ispitivanje proliferacije stanica HeLa provedeno je pomoću kompleta za brojanje stanica 8 (Dojindo) prema uputama proizvođača.
Rast E. coli DH5α analiziran je mjerenjem gustoće stanica u kulturi pomoću spektrofotometra na 600 nm (OD600).
Organizacija citoskeleta u transgenim BY-2 stanicama promatrana je korištenjem fluorescentnog mikroskopa opremljenog uređajem za konfokalno skeniranje CSU-X1 (Yokogawa) i sCMOS kamerom (Zyla, Andor Technology).Gustoća citoskeleta procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletalnih piksela među citoplazmatskim pikselima u konfokalnim slikama pomoću softvera ImageJ kako je opisano38,39.
Da bi se detektirala stanična smrt u BY-2 stanicama, alikvot stanične suspenzije je inkubiran s 0,05% Evans blue tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi.Selektivno Evansovo plavo bojenje mrtvih stanica ovisi o istiskivanju boje iz živih stanica intaktnom plazma membranom40.Obojene stanice promatrane su pomoću mikroskopa sa svijetlim poljem (BX53, Olympus).
HeLa stanice su uzgajane u DMEM-u s dodatkom 10% FBS-a u vlažnom inkubatoru na 37°C i 5% CO2.Stanice su tretirane sa 100 µM KAND 11, kumamonaminskom kiselinom 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemidom (Gibco) ili 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) tijekom 6 sati na 37°C.Stanice su fiksirane s MetOH 10 minuta i zatim s acetatom 5 minuta na sobnoj temperaturi.Fiksirane stanice su inkubirane s primarnim antitijelom β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) razrijeđenim u 0,5% BSA/PBS tijekom 2 sata, isprane 3 puta s TBST, a zatim inkubirane s Alexa Fluor kozjim antitijelom.488 1 sat.– Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) razrijeđenog u 0,5% BSA/PBS.Nakon ispiranja s TBST tri puta, obojene stanice promatrane su na Nikon Eclipse Ti-E invertiranom mikroskopu.Slike su snimljene hlađenom Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerom pomoću softvera MetaMorph (Molecular Devices).
Vrijeme objave: 17. lipnja 2024