Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje rezultate preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Otkriće i korisna upotreba prirodnih proizvoda mogu pomoći u poboljšanju ljudskog života. Kemikalije koje inhibiraju rast biljaka široko se koriste kao herbicidi za suzbijanje korova. Zbog potrebe za korištenjem različitih vrsta herbicida, potrebno je identificirati spojeve s novim mehanizmima djelovanja. U ovoj studiji otkrili smo novi N-alkoksipirolni spoj, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i uspostavili cjeloviti proces sinteze. Ispitivanjima biološke aktivnosti otkrili smo da je urs-monoaminska kiselina sintetski međuprodukt urs-monoamida i potencijalni...inhibitor rasta biljakaOsim toga, razvili smo različite derivate urbenonske kiseline, uključujući urbeniloksi derivat (UDA), koji ima visoku herbicidnu aktivnost bez negativnog utjecaja na rast HeLa stanica. Također smo otkrili da derivati urmotonske kiseline oštećuju biljne mikrotubule; osim toga, KAND utječe na aktinske filamente i inducira staničnu smrt; Ovi višestruki učinci razlikuju se od onih poznatih inhibitora mikrotubula i sugeriraju novi mehanizam djelovanja ursonske kiseline, što predstavlja važnu prednost u razvoju novih herbicida.
Otkriće i praktična primjena korisnih prirodnih proizvoda i njihovih derivata sredstvo je za poboljšanje kvalitete ljudskog života. Sekundarni metaboliti koje proizvode mikroorganizmi, biljke i insekti doveli su do velikog napretka u medicini i poljoprivredi. Mnogi antibiotici i lijekovi protiv leukemije razvijeni su iz prirodnih proizvoda. Osim toga, razne vrstepesticidi, fungicidi i herbicidi ekstrahiraju se iz ovih prirodnih proizvoda za upotrebu u poljoprivredi. Posebno su herbicidi za suzbijanje korova važni alati za povećanje prinosa usjeva u modernoj poljoprivredi, a različite vrste spojeva već se komercijalno koriste. Nekoliko staničnih procesa u biljkama, poput fotosinteze, metabolizma aminokiselina, sinteze stanične stijenke, regulacije mitoze, signalizacije fitohormona ili sinteze proteina, smatraju se tipičnim metama herbicida. Spojevi koji inhibiraju funkciju mikrotubula uobičajena su klasa herbicida koji utječu na rast biljaka utječući na mitotičku regulaciju2.
Mikrotubule su komponente citoskeleta i široko su očuvane u eukariotskim stanicama. Heterodimer tubulina sastoji se od α-tubulina i β-tubulina koji tvore linearne protofilamente mikrotubula, s 13 protofilamenata koji tvore cilindričnu strukturu. Mikrotubule igraju višestruke uloge u biljnim stanicama, uključujući određivanje oblika stanice, stanične diobe i unutarstanični transport3,4. Biljne stanice sadrže mikrotubule ispod interfazne plazma membrane, a smatra se da te takozvane kortikalne mikrotubule kontroliraju organizaciju celuloznih mikrofibrila regulacijom kompleksa celulozne sintaze4,5. Kortikalne mikrotubule stanica epiderme korijena, prisutne u zoni brzog izduživanja vrha korijena, nalaze se lateralno, a celulozna mikrovlakna prate te mikrotubule i ograničavaju smjer širenja stanica, čime potiču anizotropno izduživanje stanica. Stoga je funkcija mikrotubula usko povezana s morfologijom biljaka. Supstitucije aminokiselina u genima koji kodiraju tubulin uzrokuju iskrivljenje nizova kortikalnih mikrotubula i rast ulijevo ili udesno kod Arabidopsis 6,7. Slično tome, mutacije u proteinima povezanim s mikrotubulima koji reguliraju dinamiku mikrotubula također mogu dovesti do iskrivljenog rasta korijena8,9,10,11,12,13. Osim toga, tretman herbicidima koji ometaju mikrotubule, poput dizopiramida, poznatog i kao pretilaklor, također uzrokuje rast korijena u lijevoj strani14. Ovi podaci ukazuju na to da je precizna regulacija funkcije mikrotubula ključna za određivanje smjera rasta biljke.
Otkrivene su različite vrste inhibitora mikrotubula, a ti su lijekovi dali značajan doprinos istraživanjima citoskeleta, kao i poljoprivredi i medicini2. Posebno, orizalin, dinitroanilinski spojevi, dizopiramid, spojevi srodni benzamidu i njihovi analozi mogu inhibirati funkciju mikrotubula i time inhibirati rast biljaka. Stoga se široko koriste kao herbicidi. Međutim, budući da su mikrotubule važna komponenta biljnih i životinjskih stanica, većina inhibitora mikrotubula citotoksična je za obje vrste stanica. Stoga se, unatoč njihovoj prepoznatoj korisnosti kao herbicida, ograničen broj antimikrotubularnih sredstava koristi u praktične svrhe.
Streptomyces je rod porodice Streptomyces, koja uključuje aerobne, gram-pozitivne, nitaste bakterije i široko je poznata po svojoj sposobnosti proizvodnje širokog raspona sekundarnih metabolita. Stoga se smatra jednim od najvažnijih izvora novih biološki aktivnih prirodnih proizvoda. U trenutnoj studiji otkrili smo novi spoj nazvan kumamonamid, koji je izoliran iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Korištenjem spektralne analize i potpune spektralne analize karakterizirana je struktura kumamonamida i određen je njegov jedinstveni N-alkoksipirolni skelet. Utvrđeno je da ursmonska kiselina, sintetski međuprodukt ursmonoamida i njegovih derivata, inhibira rast i klijanje popularne modelne biljke Arabidopsis thaliana. U studiji odnosa strukture i aktivnosti otkrili smo da spoj s C9 modificiranim u ursonsku kiselinu, nazvan noniloksi derivat ursonske kiseline (KAND), značajno pojačava inhibitorni učinak na rast i klijanje. Značajno je da je novootkriveni inhibitor rasta biljaka također utjecao na rast duhana i jetrenjače te nije bio citotoksičan za bakterije ili HeLa stanice. Štoviše, neki derivati urmotonske kiseline induciraju iskrivljeni fenotip korijena, što implicira da ti derivati izravno ili neizravno utječu na mikrotubule. U skladu s tom idejom, naša opažanja mikrotubula obilježenih imunohistokemijski ili fluorescentnim proteinima ukazuju na to da KAND tretman depolimerizira mikrotubule. Osim toga, tretman derivatima kumamotonske kiseline poremetio je aktinske mikrofilamente. Stoga smo otkrili novi inhibitor rasta biljaka čiji jedinstveni mehanizam djelovanja uključuje uništavanje citoskeleta.
Soj MK493-CF1 izoliran je iz tla u Shinagawa-kuu, Tokio. Soj MK493-CF1 formirao je dobro razgranati stromalni micelij. Određena je djelomična sekvenca gena 16S ribosomske RNA (1422 bp). Ovaj soj je vrlo sličan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipičan soj, 99,93%). Na temelju ovog rezultata utvrđeno je da je ovaj soj usko povezan s tipskim sojem S. werraensis. Stoga smo ovaj soj privremeno nazvali S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T također proizvodi iste bioaktivne spojeve. Budući da je u ranoj fazi bilo malo istraživanja o dobivanju prirodnih proizvoda iz ovog mikroorganizma, provedena su daljnja kemijska istraživanja. Nakon uzgoja S. werraensis MK493-CF1 na ječmenom mediju fermentacijom u čvrstom stanju na 30°C tijekom 14 dana, medij je ekstrahiran s 50% EtOH. 60 ml uzorka je osušeno da bi se dobilo 59,5 mg sirovog ekstrakta. Sirovi ekstrakt je podvrgnut HPLC-u reverzne faze da bi se dobio N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, nazvan kumamonamid, 36,0 mg). Ukupna količina 1 je približno 60% sirovog ekstrakta. Stoga smo odlučili detaljno proučiti svojstva kumamotomida 1.
Kumamonamid 1 je bijeli amorfni prah, a masena spektrometrija visoke rezolucije (HRESIMS) potvrđuje C6H8N2O2 (slika 1). C2-supstituirani pirolni fragment ovog spoja karakteriziran je s δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH u 1H NMR spektru: 4,5 Hz, H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a 13C NMR spektar pokazuje prisutnost četiri sp2 atoma ugljika. Prisutnost amidne skupine na položaju C2 procijenjena je HMBC korelacijom od protona C-3 do amidnog karbonilnog ugljika pri δC 161,1. Osim toga, 1H i 13C NMR vrhovi na δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 ukazuju na prisutnost N-metoksi skupina u molekuli. Iako točan položaj metoksi skupine još nije bio određen spektroskopskom analizom poput spektroskopije s poboljšanom razlikom i nuklearne Overhauserove kratice (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid postao je prvi kandidat za spoj.
Kako bi se odredila ispravna struktura 1, provedena je totalna sinteza (slika 2a). Obrada komercijalno dostupnog 2-aminopiridina 2 s m-CPBA rezultirala je odgovarajućim N-oksidom 3 u kvantitativnom prinosu. Nakon 2-aminoazidacije 2, reakcija ciklokondenzacije koju je opisao Abramovich provedena je u benzenu na 90°C kako bi se dobio željeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 u gramima. Brzina 60% (dva stupnja). 15,16. Metilacija i hidroliza 4 zatim su dale 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (nazvanu "kumotonska kiselina", 6) u dobrom prinosu (70%, dva koraka). Konačno, amidacija putem međuprodukta kiselinskog klorida 6 korištenjem vodenog amonijaka dala je Kumamoto amid 1 u prinosu od 98%. Svi spektralni podaci sintetiziranog 1 bili su slični izoliranom 1, pa je određena struktura 1;
Opća sinteza i analiza biološke aktivnosti urbenamida i urbenske kiseline. (a) Ukupna sinteza Kumamoto amida. (b) Sedmodnevne sadnice divljeg tipa Arabidopsis Columbia (Col) uzgajane su na Murashige i Skoog (MS) pločama koje su sadržavale kumamonamid 6 ili kumamonamid 1 u navedenim koncentracijama. Mjerilo = 1 cm.
Prvo smo procijenili biološke aktivnosti urbenamida i njegovih međuprodukata s obzirom na njihovu sposobnost modulacije rasta biljaka. Dodali smo različite koncentracije ursmonamida 1 ili ursmonske kiseline 6 u MS agar medij i uzgajali sadnice Arabidopsis thaliana na tom mediju. Ovi testovi pokazali su da visoke koncentracije (500 μM) 6 inhibiraju rast korijena (slika 2b). Zatim smo generirali različite derivate zamjenom N1 položaja 6 i proveli studije odnosa strukture i aktivnosti na njima (proces sinteze analoga opisan je u Dodatnim informacijama (SI)). Sadnice Arabidopsis uzgajane su na mediju koji sadrži 50 μM derivata ursonske kiseline, a duljina korijena je izmjerena kao što je prikazano na slici. Kao što je prikazano na slikama 3a, b i S1, kumamo kiseline imaju različite duljine linearnih alkoksilnih lanaca (9, 10, 11, 12 i 13) ili velikih alkoksilnih lanaca (15, 16 i 17) na N1 položaju. Derivati su pokazali značajnu inhibiciju rasta korijena. Osim toga, otkrili smo da primjena 200 μM 10, 11 ili 17 inhibira klijanje (slike 3c i S2).
Proučavanje odnosa strukture i aktivnosti Kumamoto amida i srodnih spojeva. (a) Struktura i shema sinteze analoga. (b) Kvantifikacija duljine korijena 7 dana starih sadnica uzgojenih na MS mediju sa ili bez 50 μM derivata kumamonamida. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>18. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. nt znači „nije testirano“ jer više od 50% sjemenki nije proklijalo. (c) Kvantifikacija stope klijanja tretiranih sjemenki inkubiranih 7 dana u MS mediju sa ili bez 200 μM kumamonamida i srodnih spojeva. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (hi-kvadrat test). n=96.
Zanimljivo je da je dodatak alkilnih bočnih lanaca duljih od C9 smanjio inhibitornu aktivnost, što sugerira da spojevi srodni kumamotoičnoj kiselini zahtijevaju bočne lance određene veličine kako bi pokazali svoju biološku aktivnost.
Budući da je analiza odnosa strukture i aktivnosti pokazala da je C9 modificiran u ursonsku kiselinu, a noniloksi derivat ursonske kiseline (u daljnjem tekstu KAND 11) bio je najučinkovitiji inhibitor rasta biljaka, proveli smo detaljniju karakterizaciju KAND 11. Tretman Arabidopsis s 50 μM KAND 11 gotovo je u potpunosti spriječio klijanje, dok su niže koncentracije (40, 30, 20 ili 10 μM) KAND 11 inhibirale rast korijena na način ovisan o dozi (slika 4a, b). Kako bismo testirali utječe li KAND 11 na održivost korijenskog meristema, ispitali smo korijenske meristeme obojene propidijevim jodidom (PI) i izmjerili veličinu površine meristema. Veličina meristema sadnica uzgojenih na mediju koji sadrži 25 μM KAND-11 bila je 151,1 ± 32,5 μm, dok je veličina meristema sadnica uzgojenih na kontrolnom mediju koji sadrži DMSO bila 264,7 ± 30,8 μm (slika 4c, d), što ukazuje na to da KAND-11 obnavlja staničnu aktivnost. širenje. Korijen meristem. U skladu s tim, tretman s KAND-11 smanjio je količinu signala markera stanične diobe CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS u korijenovom meristemu (slika 4e) 17. Ovi rezultati ukazuju na to da KAND 11 inhibira rast korijena smanjenjem aktivnosti proliferacije stanica.
Analiza inhibitornog učinka derivata urbenonske kiseline (urbeniloksi derivata) na rast. (a) 7 dana stare sadnice divljeg tipa Col uzgojene na MS pločama s naznačenim koncentracijama KAND 11. Mjerilo = 1 cm. (b) Kvantifikacija duljine korijena. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). n>16. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. (c) Konfokalna mikroskopija korijena divljeg tipa Col obojenog propidij jodidom uzgojenog na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11. Bijele zagrade označavaju meristem korijena. Mjerilo = 100 µm. (d) Kvantifikacija veličine meristema korijena (n = 10 do 11). Statističke razlike određene su t-testom (p< 0,05). Stupci predstavljaju prosječnu veličinu meristema. (e) Mikroskopija diferencijalnog interferentnog kontrasta (DIC) korijenskog meristema koji sadrži CDKB2 konstrukt; 1pro: CDKB2; 1-GUS obojeno i obojeno na 5 dana starim sadnicama uzgojenim na MS pločama sa ili bez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND-a 11 dodatno je testirana korištenjem druge dvosupnice, duhana (Nicotiana tabacum) i glavnog modelnog organizma kopnene biljke, jetrenjače (Marchantia polymorpha). Kao i u slučaju Arabidopsis, sadnice duhana SR-1 uzgojene na mediju koji sadrži 25 μM KAND-a 11 proizvele su kraće korijenje (slika 5a). Osim toga, 40 od 48 sjemenki proklijalo je na pločama koje su sadržavale 200 μM KAND-a 11, dok je svih 48 sjemenki proklijalo na simuliranom mediju, što ukazuje na to da su veće koncentracije KAND-a bile značajne (p< 0,05; hi test - kvadrat) inhibirao je klijanje duhana. (Sl. 5b). Osim toga, koncentracija KAND 11 koja je inhibirala rast bakterija u jetrenjači bila je slična učinkovitoj koncentraciji u Arabidopsisu (Sl. 5c). Ovi rezultati ukazuju na to da KAND 11 može inhibirati rast raznih biljaka. Zatim smo istražili moguću citotoksičnost spojeva povezanih s monoamidima medvjeda u drugim organizmima, naime ljudskim HeLa stanicama i soju Escherichia coli DH5α, kao predstavnicima viših životinjskih, odnosno bakterijskih stanica. U nizu testova proliferacije stanica primijetili smo da kumamonamid 1, kumamonamidna kiselina 6 i KAND 11 nisu utjecali na rast HeLa ili E. coli stanica pri koncentracijama od 100 μM (Sl. 5d,e).
Inhibicija rasta KAND 11 u organizmima koji nisu Arabidopsis. (a) Dva tjedna stare sadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na vertikalno postavljenim MS pločama koje su sadržavale 25 μM KAND 11. (b) Dva tjedna stare sadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na horizontalno postavljenim MS pločama koje su sadržavale 200 μM KAND 11. (c) Dva tjedna stari pupoljci jetrenjače divljeg tipa Tak-1 uzgajani na Gamborg B5 pločama s naznačenim koncentracijama KAND 11. Crvene strelice označavaju spore koje su prestale rasti unutar dva tjedna inkubacije. (d) Test proliferacije stanica HeLa. Broj održivih stanica mjeren je u fiksnim vremenskim intervalima pomoću kompleta za brojanje stanica 8 (Dojindo). Kao kontrola, HeLa stanice tretirane su s 5 μg/ml aktinomicina D (Act D), koji inhibira transkripciju RNA polimeraze i uzrokuje staničnu smrt. Analize su provedene u tri primjerka. (e) Test proliferacije stanica E. coli. Rast E. coli analiziran je mjerenjem OD600. Kao kontrola, stanice su tretirane s 50 μg/ml ampicilina (Amp), koji inhibira sintezu bakterijske stanične stijenke. Analize su provedene u tri ponavljanja.
Kako bismo dešifrirali mehanizam djelovanja citotoksičnosti uzrokovane spojevima srodnim uramidu, ponovno smo analizirali derivate urbenske kiseline s umjerenim inhibitornim učincima, kao što je prikazano na slici. Kao što je prikazano na slikama 2b i 6a, sadnice uzgojene na agar pločama koje sadrže visoke koncentracije (200 μM) urmotonske kiseline 6 proizvele su kraće i lijevo zakrivljeno korijenje (θ = – 23,7 ± 6,1), dok su sadnice uzgojene na kontrolnom mediju proizvele gotovo ravno korijenje (θ = – 3,8 ± 7,1). Poznato je da ovaj karakteristični kosi rast rezultat je disfunkcije kortikalnih mikrotubula14,18. U skladu s ovim nalazom, lijekovi koji destabiliziraju mikrotubule, dizopiramid i orizalin, izazvali su slično naginjanje korijena u našim uvjetima rasta (slike 2b i 6a). Istovremeno, testirali smo derivate urmotonske kiseline i odabrali nekoliko njih koji su, pri određenim koncentracijama, izazvali kosi rast korijena. Spojevi 8, 9 i 15 promijenili su smjer rasta korijena pri 75 μM, 50 μM i 40 μM, što ukazuje na to da ovi spojevi mogu učinkovito destabilizirati mikrotubule (slika 2b, 6a). Također smo testirali najpotentniji derivat ursolne kiseline, KAND 11, pri nižoj koncentraciji (15 µM) i otkrili da primjena KAND 11 inhibira rast korijena i da je smjer rasta korijena neravnomjeran, iako se naginje ulijevo (slika C3). Budući da veće koncentracije lijekova koji destabiliziraju mikrotubule ponekad inhibiraju rast biljaka, a ne uzrokuju naginjanje korijena, naknadno smo procijenili mogućnost da KAND 11 utječe na mikrotubule promatrajući kortikalne mikrotubule u epidermalnim stanicama korijena. Imunohistokemija korištenjem anti-β-tubulinskih antitijela u epidermalnim stanicama korijena sadnica tretiranih s 25 μM KAND 11 pokazala je nestanak gotovo svih kortikalnih mikrotubula u epidermalnim stanicama u zoni elongacije (slika 6b). Ovi rezultati ukazuju na to da kumamotonska kiselina i njezini derivati izravno ili neizravno djeluju na mikrotubule kako bi ih poremetili te da su ovi spojevi novi inhibitori mikrotubula.
Ursonska kiselina i njezini derivati mijenjaju kortikalne mikrotubule u Arabidopsis thaliana. (a) Kut nagiba korijena izmjeren u prisutnosti različitih derivata urmotonske kiseline u navedenim koncentracijama. Također su analizirani učinci dvaju spojeva za koje se zna da inhibiraju mikrotubule: dizopiramida i orizalina. Umetak prikazuje standard koji se koristi za mjerenje kuta rasta korijena. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>19. Mjerilo = 1 cm. (b) Kortikalni mikrotubulovi u epidermalnim stanicama u zoni elongacije. Mikrotubulovi u korijenu divljeg tipa Arabidopsis Col uzgojenom na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11 vizualizirani su imunohistokemijskim bojenjem pomoću primarnih antitijela protiv β-tubulina i sekundarnih antitijela konjugiranih s Alexa Fluorom. Mjerilo = 10 µm. (c) Mitotička struktura mikrotubula u meristemu korijena. Mikrotubulovi su vizualizirani imunohistokemijskim bojenjem. Mitotičke strukture, uključujući profazne zone, vretena i fragmoplaste, prebrojane su iz konfokalnih slika. Strelice označavaju mitotičke strukture mikrotubula. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>9. Mjerna traka = 50 µm.
Iako Ursa ima sposobnost ometanja funkcije mikrotubula, očekuje se da će se njezin mehanizam djelovanja razlikovati od tipičnih sredstava za depolimerizaciju mikrotubula. Na primjer, veće koncentracije sredstava za depolimerizaciju mikrotubula poput dizopiramida i orizalina induciraju anizotropnu ekspanziju epidermalnih stanica, dok KAND 11 to ne čini. Osim toga, istovremena primjena KAND 11 i dizopiramida rezultirala je kombiniranim odgovorom rasta korijena induciranim dizopiramidom, a uočena je i inhibicija rasta inducirana KAND 11 (slika S4). Također smo analizirali odgovor preosjetljivog mutanta dizopiramid 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ima nekanonsku točkastu mutaciju tubulin kinaze i proizvodi kraće korijenje kada se tretira dizopiramidom9,20. Sadnice mutanta phs1-1 uzgojene na agar mediju koji sadrži KAND 11 imale su kraće korijenje slično onima uzgojenim na dizopiramidu (slika S5).
Osim toga, uočili smo mitotičke strukture mikrotubula, poput profaznih zona, vretena i fragmoplasta, u korijenovom meristemu sadnica tretiranih s KAND 11. U skladu s opažanjima za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, uočeno je značajno smanjenje broja mitotičkih mikrotubula (slika .6c).
Kako bismo karakterizirali citotoksičnost KAND-a 11 pri subcelularnoj rezoluciji, tretirali smo suspenzijske stanice duhana BY-2 s KAND-om 11 i promatrali njihov odgovor. Prvo smo dodali KAND 11 stanicama BY-2 koje eksprimiraju TagRFP-TUA6, koji fluorescentno označava mikrotubule, kako bismo procijenili učinak KAND-a 11 na kortikalne mikrotubule. Gustoća kortikalnih mikrotubula procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletnih piksela među citoplazmatskim pikselima. Rezultati testa pokazali su da se nakon tretmana s 50 μM ili 100 μM KAND-a 11 tijekom 1 sata gustoća značajno smanjila na 0,94 ± 0,74% odnosno 0,23 ± 0,28%, dok je gustoća stanica tretiranih DMSO-om iznosila 1,61 ± 0,34% (slika 7a). Ovi rezultati su u skladu s opažanjem kod Arabidopsis da tretman s KAND-om 11 inducira depolimerizaciju kortikalnih mikrotubula (slika 6b). Također smo ispitali liniju BY-2 s aktinskim filamentima obilježenim GFP-ABD-om nakon tretmana istom koncentracijom KAND 11 i primijetili da je tretman KAND 11 poremetio aktinske filamente. Tretman s 50 μM ili 100 μM KAND 11 tijekom 1 sata značajno je smanjio gustoću aktinskih filamenata na 1,20 ± 0,62% odnosno 0,61 ± 0,26%, dok je gustoća u stanicama tretiranim DMSO-om bila 1,69 ± 0,51% (slika 2). 7b). Ovi rezultati su u suprotnosti s učincima propizamida, koji ne utječe na aktinske filamente, i latrunkulina B, depolimerizatora aktina koji ne utječe na mikrotubule (SI slika S6). Osim toga, tretman kumamonamidom 1, kumamonamidnom kiselinom 6 ili KAND 11 nije utjecao na mikrotubule u HeLa stanicama (SI slika S7). Stoga se vjeruje da je mehanizam djelovanja KAND-a 11 drugačiji od mehanizma poznatih disruptora citoskeleta. Osim toga, naše mikroskopsko promatranje BY-2 stanica tretiranih s KAND-om 11 otkrilo je početak stanične smrti tijekom tretmana s KAND-om 11 i pokazalo da se udio mrtvih stanica obojenih Evansovim plavo nije značajno povećao nakon 30 minuta tretmana s KAND-om 11, dok se nakon 90 minuta tretmana s 50 μM ili 100 μM KAND-a broj mrtvih stanica povećao na 43,7% odnosno 80,1% (slika 7c). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je novi derivat ursolne kiseline KAND 11 biljni inhibitor citoskeleta s prethodno nepoznatim mehanizmom djelovanja.
KAND utječe na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente i vijabilnost BY-2 stanica duhana. (a) Vizualizacija kortikalnih mikrotubula u BY-2 stanicama u prisutnosti TagRFP-TUA6. BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom. Gustoća kortikalnih mikrotubula izračunata je iz mikrografija 25 neovisnih stanica. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). Mjerilo = 10 µm. (b) Kortikalni aktinski filamenti u BY-2 stanicama vizualizirani u prisutnosti GFP-ABD2. BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom. Gustoća kortikalnih aktinskih filamenata izračunata je iz mikrografija 25 neovisnih stanica. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). Mjerilo = 10 µm. (c) Promatranje mrtvih BY-2 stanica bojenjem Evansovim plavilom. BY-2 stanice tretirane s KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO pregledane su mikroskopijom svijetlog polja. n=3. Mjerilo = 100 µm.
Otkriće i primjena novih prirodnih proizvoda doveli su do značajnog napretka u različitim aspektima ljudskog života, uključujući medicinu i poljoprivredu. Provedena su povijesna istraživanja kako bi se dobili korisni spojevi iz prirodnih resursa. Posebno su poznati aktinomiceti kao korisni antiparazitski antibiotici za nematode zbog svoje sposobnosti proizvodnje različitih sekundarnih metabolita poput avermektina, vodećeg spoja ivermektina, te bleomicina i njegovih derivata, koji se medicinski koriste kao sredstvo protiv raka21,22. Slično tome, otkriveni su razni herbicidni spojevi iz aktinomiceta, od kojih se neki već komercijalno koriste1,23. Stoga se analiza metabolita aktinomiceta radi izolacije prirodnih proizvoda sa željenim biološkim aktivnostima smatra učinkovitom strategijom. U ovoj studiji otkrili smo novi spoj, kumamonamid, iz S. werraensis i uspješno ga sintetizirali. Ursonska kiselina je sintetski međuprodukt urbenamida i njegovih derivata. Može uzrokovati karakteristično uvijanje korijena, pokazivati umjerenu do jaku herbicidnu aktivnost i izravno ili neizravno oštetiti biljne mikrotubule. Međutim, mehanizam djelovanja urmotonske kiseline može se razlikovati od mehanizma djelovanja postojećih inhibitora mikrotubula, budući da KAND 11 također remeti aktinske filamente i uzrokuje staničnu smrt, što sugerira regulatorni mehanizam kojim urmotonska kiselina i njezini derivati utječu na širok raspon citoskeletnih struktura.
Daljnja detaljna karakterizacija urbenonske kiseline pomoći će boljem razumijevanju mehanizma djelovanja urbenonske kiseline. Sljedeći cilj je procijeniti sposobnost ursonske kiseline da se veže za reducirane mikrotubule kako bi se utvrdilo djeluju li ursonska kiselina i njezini derivati izravno na mikrotubule i depolimeriziraju li ih ili njihovo djelovanje rezultira destabilizacijom mikrotubula. Osim toga, u slučaju kada mikrotubule nisu izravna meta, identificiranje mjesta djelovanja i molekularnih ciljeva ursonske kiseline na biljnim stanicama pomoći će u daljnjem razumijevanju svojstava srodnih spojeva i mogućih načina poboljšanja herbicidne aktivnosti. Naš test bioaktivnosti otkrio je jedinstvenu citotoksičnu sposobnost ursonske kiseline na rast biljaka poput Arabidopsis thaliana, duhana i jetrenjače, dok ni stanice E. coli ni HeLa nisu bile pogođene. Mala ili nikakva toksičnost za životinjske stanice prednost je derivata ursonske kiseline ako se razviju kao herbicidi za upotrebu na otvorenim poljoprivrednim poljima. Doista, budući da su mikrotubule uobičajene strukture u eukariota, njihova selektivna inhibicija u biljkama ključni je zahtjev za herbicide. Na primjer, propizamid, sredstvo za depolimerizaciju mikrotubula koje se izravno veže na tubulin i inhibira polimerizaciju, koristi se kao herbicid zbog svoje niske toksičnosti za životinjske stanice24. Za razliku od dizopiramida, srodni benzamidi imaju različite specifičnosti djelovanja na ciljne skupine. Osim biljnih mikrotubula, RH-4032 ili benzoksamid također inhibira mikrotubule životinjskih stanica odnosno oomiceta, a zalilamid se koristi kao fungicid zbog svoje niske fitotoksičnosti25,26,27. Novootkriveni medvjed i njegovi derivati pokazuju selektivnu citotoksičnost protiv biljaka, ali vrijedi napomenuti da daljnje modifikacije mogu promijeniti njihovu specifičnost djelovanja na ciljne skupine, potencijalno pružajući dodatne derivate za kontrolu patogenih gljivica ili oomiceta.
Jedinstvena svojstva urbenonske kiseline i njezinih derivata korisna su za njihov razvoj kao herbicida i upotrebu kao istraživačkih alata. Važnost citoskeleta u kontroli oblika biljnih stanica široko je prepoznata. Ranije studije pokazale su da su biljke razvile složene mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula kontroliranjem dinamike mikrotubula kako bi pravilno kontrolirale morfogenezu. Identificiran je veliki broj molekula odgovornih za regulaciju aktivnosti mikrotubula, a srodna istraživanja još uvijek traju3,4,28. Naše trenutno razumijevanje dinamike mikrotubula u biljnim stanicama ne objašnjava u potpunosti mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula. Na primjer, iako i dizopiramid i orizalin mogu depolimerizirati mikrotubule, dizopiramid uzrokuje ozbiljno izobličenje korijena, dok orizalin ima relativno blag učinak. Štoviše, mutacije u tubulinu, koji stabilizira mikrotubule, također uzrokuju dekstrorotaciju u korijenu, dok paklitaksel, koji također stabilizira dinamiku mikrotubula, to ne čini. Stoga bi proučavanje i identificiranje molekularnih ciljeva ursolne kiseline trebalo pružiti nove uvide u regulaciju biljnih kortikalnih mikrotubula. Slično tome, buduće usporedbe kemikalija koje učinkovito potiču iskrivljeni rast, poput disopiramida, i manje učinkovitih kemikalija, poput orizalina ili kumamotorne kiseline, pružit će tragove o tome kako dolazi do iskrivljenog rasta.
S druge strane, obrambeno preuređenje citoskeleta još je jedna mogućnost za objašnjenje citotoksičnosti ursonske kiseline. Infekcija patogenom ili unošenje elicitora u biljne stanice ponekad uzrokuje uništavanje citoskeleta i posljedično staničnu smrt29. Na primjer, zabilježeno je da kriptoksantin izveden iz oomiceta remeti mikrotubule i aktinske filamente prije smrti stanica duhana, slično onome što se događa s KAND tretmanom30,31. Sličnosti između obrambenih odgovora i staničnih odgovora izazvanih ursonskom kiselinom navele su nas na hipotezu da oni pokreću uobičajene stanične procese, iako je očit brži i jači učinak ursonske kiseline nego kriptoksantina. Međutim, studije su pokazale da remećenje aktinskih filamenata potiče spontanu staničnu smrt, koja nije uvijek popraćena remećenjem mikrotubula29. Osim toga, ostaje za vidjeti uzrokuje li patogen ili elicitor iskrivljeni rast korijena, kao što to čine derivati ursonske kiseline. Stoga je molekularno znanje koje povezuje obrambene odgovore i citoskelet atraktivan problem koji treba riješiti. Iskorištavanjem prisutnosti spojeva niske molekularne težine srodnih ursonskoj kiselini, kao i niza derivata s različitim potencijalima, mogu pružiti mogućnosti ciljanja nepoznatih staničnih mehanizama.
Uzevši sve u obzir, otkriće i primjena novih spojeva koji moduliraju dinamiku mikrotubula pružit će snažne metode za rješavanje složenih molekularnih mehanizama koji leže u osnovi određivanja oblika biljnih stanica. U tom kontekstu, nedavno razvijeni spoj urmotonska kiselina, koja utječe na mikrotubule i aktinske filamente te inducira staničnu smrt, može pružiti priliku za dešifriranje veze između kontrole mikrotubula i tih drugih mehanizama. Stoga će nam kemijska i biološka analiza korištenjem urbenonske kiseline pomoći da razumijemo molekularne regulatorne mehanizme koji kontroliraju biljni citoskelet.
Inokulirajte S. werraensis MK493-CF1 u Erlenmeyerovu tikvicu s pregradama od 500 mL koja sadrži 110 mL medija za sjeme koji se sastoji od 2% (w/v) galaktoze, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto sastava.-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrakta kukuruza (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 u deioniziranoj vodi. (pH 7,4 prije sterilizacije). Sjemenske kulture inkubirane su na rotacijskoj tresilici (180 rpm) na 27°C tijekom 2 dana. Proizvodni uzgoj putem fermentacije na čvrstom stanju. Sjemenska kultura (7 ml) prenesena je u K-1 tikvicu od 500 ml koja sadrži 40 g produkcijskog medija koji se sastoji od 15 g prešanog ječma (MUSO Co., Ltd., Japan) i 25 g deionizirane vode (pH nije podešen prije sterilizacije). Fermentacija je provedena na 30°C u mraku tijekom 14 dana. Fermentacijski materijal ekstrahiran je s 40 ml/boca EtOH i centrifugiran (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatant kulture (60 ml) ekstrahiran je smjesom 10% MeOH/EtOAc. Organski sloj je uparen pod smanjenim tlakom da bi se dobio ostatak (59,5 mg), koji je podvrgnut HPLC-u s gradijentnom elucijom (0–10 minuta: 90%) na koloni reverzne faze (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × duljina 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuta: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradijent), 35–45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuta: 90% H2O/EtOH do 100% EtOH (gradijent (gradijent), 155–200 min: 100% EtOH) pri brzini protoka od 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) je izoliran kao bijeli amorfni prah.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunata vrijednost: 141,0659, izmjerena vrijednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Sjemenke vrste Columbia (Col-0) nabavljene su iz Centra za biološke resurse Arabidopsis (ABRC) uz dopuštenje za istraživačku upotrebu. Sjemenke vrste Col-0 razmnožene su i održavane u našim laboratorijskim uvjetima te korištene kao biljke divljeg tipa Arabidopsis. Sjemenke vrste Arabidopsis površinski su sterilizirane i uzgajane u Murashige i Skoog mediju upola slabije koncentracije koji sadrži 2% saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). i 1,5% agara (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, na 23 °C i konstantnom svjetlu. Sjemenke mutanta phs1-1 osigurao je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sjeme soja SR-1 osigurao je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) i korišteno je kao biljke duhana divljeg tipa. Sjeme duhana je površinski sterilizirano i natopljeno u sterilnoj vodi tri noći kako bi se potaknulo klijanje, zatim stavljeno u otopinu upola jače koncentracije koja sadrži 2% saharoze, 0,05% (w/v) MES-a i 0,8% gelan gume (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. i Skoog medij) s pH 5,7 i inkubirano na 23°C pod konstantnim svjetlom.
Soj Tak-1 osigurao je T. Kohchi (Sveučilište u Kyotu) i korišten je kao standardna eksperimentalna jedinica za proučavanje jetrenjače. Gemma je dobivena iz steriliziranih kultiviranih biljaka, a zatim nasađena na Gamborg B5 medij (Fujifilm Wako Pure Chemical) koji sadrži 1% saharoze i 0,3% gelan gume te inkubirana na 23°C pod stalnim svjetlom.
Stanice duhana BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) osigurao je S. Hasezawa (Sveučilište u Tokiju). Stanice BY-2 razrijeđene su 95 puta u modificiranom Linsmeier i Skoog mediju i tjedno nadopunjavane 2,4-diklorofenoksioctenom kiselinom 32. Stanična suspenzija miješana je na rotacijskoj tresilici pri 130 okretaja u minuti na 27°C u mraku. Stanice se isperu s 10 puta većim volumenom svježeg medija i resuspendiraju u istom mediju. Transgene stanične linije BY-2 koje stabilno eksprimiraju marker mikrotubula TagRFP-TUA6 ili marker aktinskih filamenata GFP-ABD2 pod promotorom 35S virusa mozaika cvjetače generirane su kako je opisano 33,34,35. Ove stanične linije mogu se održavati i sinkronizirati korištenjem postupaka sličnih onima koji su korišteni za originalnu staničnu liniju BY-2.
HeLa stanice su uzgajane u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Life Technologies) nadopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma, 1,2 U/ml penicilina i 1,2 μg/ml streptomicina u inkubatoru na 37°C s 5% CO2.
Svi eksperimenti opisani u ovom rukopisu provedeni su u skladu s japanskim propisima i smjernicama o biološkoj sigurnosti.
Spojevi su otopljeni u dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kao osnovne otopine i razrijeđeni u MS mediju za Arabidopsis i duhan ili Gamborg B5 mediju za jetrenjaču. Za test inhibicije rasta korijena, više od 10 sjemenki po ploči posijano je na agar medij koji sadrži naznačene spojeve ili DMSO. Sjemenke su inkubirane u komori za rast 7 dana. Sadnice su fotografirane i izmjerena je duljina korijena. Za test klijanja Arabidopsis, 48 sjemenki po ploči posijano je na agar medij koji sadrži 200 μM spoja ili DMSO. Sjemenke Arabidopsis uzgajane su u komori za rast, a broj proklijalih sadnica prebrojan je 7 dana nakon klijanja (dag). Za test klijanja duhana, 24 sjemenke po ploči posijane su na agar medij koji sadrži 200 μM KAND-a ili DMSO-a. Sjemenke duhana uzgajane su u komori za rast, a broj proklijalih sadnica prebrojan je nakon 14 dana. Za test inhibicije rasta jetrenjače, 9 embrija iz svake ploče nasađeno je na agarni medij koji sadrži naznačene koncentracije KAND-a ili DMSO-a i inkubirano u komori za rast tijekom 14 dana.
Za vizualizaciju organizacije meristema korijena upotrijebite sadnice obojene s 5 mg/ml propidij jodida (PI). PI signali su uočeni fluorescentnom mikroskopijom pomoću TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems).
Histokemijsko bojenje korijena β-glukuronidazom (GUS) provedeno je prema protokolu koji su opisali Malami i Benfey36. Sadnice su fiksirane u 90%-tnom acetonu preko noći, obojene s 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronske kiseline u GUS puferu tijekom 1 sata i stavljene u hidratiziranu otopinu kloraldehida (8 g kloral hidrata, 2 ml vode i 1 ml glicerola) te promatrane diferencijalnom interferentnom kontrastnom mikroskopijom pomoću mikroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kutovi korijena mjereni su na 7 dana starim sadnicama uzgojenim na vertikalno postavljenim pločama. Izmjerite kut korijena od smjera vektora gravitacije kako je opisano u koraku 6.
Raspored kortikalnih mikrotubula promatran je kako je opisano, uz manje izmjene protokola 37. Anti-β-tubulinsko antitijelo (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i Alexa Fluor 488-konjugirano anti-mišje IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) korišteni su kao primarna i sekundarna antitijela u razrjeđenjima 1:1000 i 1:100. Fluorescentne slike dobivene su pomoću TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems). Snimite Z-stack slike i stvorite projekcije maksimalnog intenziteta prema uputama proizvođača.
Test proliferacije HeLa stanica proveden je korištenjem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) prema uputama proizvođača.
Rast E. coli DH5α analiziran je mjerenjem gustoće stanica u kulturi pomoću spektrofotometra na 600 nm (OD600).
Organizacija citoskeleta u transgenim BY-2 stanicama promatrana je pomoću fluorescentnog mikroskopa opremljenog konfokalnim uređajem za skeniranje CSU-X1 (Yokogawa) i sCMOS kamerom (Zyla, Andor Technology). Gustoća citoskeleta procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak piksela citoskeleta među citoplazmatskim pikselima u konfokalnim slikama pomoću softvera ImageJ kako je opisano 38,39.
Za detekciju stanične smrti u BY-2 stanicama, alikvot stanične suspenzije inkubiran je s 0,05% Evans plavilom tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Selektivno bojenje mrtvih stanica Evans plavilom ovisi o ekstruziji boje iz živih stanica putem intaktne plazma membrane40. Obojene stanice promatrane su pomoću mikroskopa svijetlog polja (BX53, Olympus).
HeLa stanice su uzgajane u DMEM-u nadopunjenom s 10% FBS-a u ovlaženom inkubatoru na 37°C i 5% CO2. Stanice su tretirane sa 100 μM KAND 11, kumamonamičnom kiselinom 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemida (Gibco) ili 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) tijekom 6 sati na 37°C. Stanice su fiksirane s MetOH tijekom 10 minuta, a zatim s acetatom tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Fiksirane stanice su inkubirane s primarnim antitijelom β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) razrijeđenim u 0,5% BSA/PBS tijekom 2 sata, isprane 3 puta s TBST-om, a zatim inkubirane s kozjim antitijelom Alexa Fluor. 488 1 sat. – Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) razrijeđenog u 0,5% BSA/PBS. Nakon trostrukog ispiranja s TBST-om, obojene stanice su promatrane na inverznom mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E. Slike su snimljene ohlađenom Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerom pomoću MetaMorph softvera (Molecular Devices).
Vrijeme objave: 17. lipnja 2024.