Da učinkovitosuzbijati komarcei smanjiti učestalost bolesti koje prenose, potrebne su strateške, održive i ekološki prihvatljive alternative kemijskim pesticidima.Procijenili smo brašno od sjemenki određenih vrsta Brassicaceae (obitelj Brassica) kao izvor izotiocijanata biljnog podrijetla proizvedenih enzimatskom hidrolizom biološki neaktivnih glukozinolata za upotrebu u kontroli egipatskih Aedes (L., 1762).Sačma od pet odmašćenih sjemenki (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – tri glavna tipa toplinske inaktivacije i enzimske razgradnje Kemijska proizvodi Za određivanje toksičnosti (LC50) alil izotiocijanata, benzil izotiocijanata i 4-hidroksibenzilizotiocijanata na ličinke Aedes aegypti pri 24-satnoj izloženosti = 0,04 g/120 ml dH2O).LC50 vrijednosti za gorušicu, bijelu gorušicu i preslicu.sjemenskog brašna bio je 0,05, 0,08 i 0,05 respektivno u usporedbi s alil izotiocijanatom (LC50 = 19,35 ppm) i 4. -Hidroksibenzilizotiocijanat (LC50 = 55,41 ppm) bio je toksičniji za ličinke 24 sata nakon tretmana od 0,1 g/120 ml dH2O respektivno.Ovi rezultati su u skladu s proizvodnjom sačme od sjemena lucerne.Veća učinkovitost benzil estera odgovara izračunatim vrijednostima LC50.Korištenje brašna od sjemena može pružiti učinkovitu metodu kontrole komaraca.učinkovitost praha sjemena križnice i njegovih glavnih kemijskih komponenti protiv ličinki komaraca i pokazuje kako prirodni spojevi u prahu sjemenki križnice mogu poslužiti kao obećavajući ekološki prihvatljiv larvicid za kontrolu komaraca.
Vektorske bolesti koje uzrokuju komarci Aedes i dalje su veliki globalni javnozdravstveni problem.Učestalost bolesti koje prenose komarci širi se geografski1,2,3 i ponovno se pojavljuje, što dovodi do izbijanja teških bolesti4,5,6,7.Širenje bolesti među ljudima i životinjama (npr. chikungunya, denga groznica, groznica Rift Valley, žuta groznica i Zika virus) je bez presedana.Samo denga groznica izlaže približno 3,6 milijardi ljudi riziku od zaraze u tropima, s procijenjenim 390 milijuna infekcija koje se događaju godišnje, što rezultira sa 6 100 – 24 300 smrtnih slučajeva godišnje8.Ponovno pojavljivanje i izbijanje virusa Zika u Južnoj Americi privuklo je svjetsku pozornost zbog oštećenja mozga koje uzrokuje kod djece rođene od zaraženih žena2.Kremer i suradnici 3 predviđaju da će se zemljopisni raspon komaraca Aedes nastaviti širiti i da će do 2050. polovica svjetske populacije biti u opasnosti od infekcije arbovirusima koje prenose komarci.
S izuzetkom nedavno razvijenih cjepiva protiv denga groznice i žute groznice, cjepiva protiv većine bolesti koje prenose komarci još nisu razvijena9,10,11.Cjepiva su još uvijek dostupna u ograničenim količinama i koriste se samo u kliničkim ispitivanjima.Kontrola vektora komaraca korištenjem sintetskih insekticida bila je ključna strategija za kontrolu širenja bolesti koje prenose komarci12,13.Iako su sintetski pesticidi učinkoviti u ubijanju komaraca, kontinuirana uporaba sintetičkih pesticida negativno utječe na neciljane organizme i zagađuje okoliš14,15,16.Još je alarmantniji trend povećanja otpornosti komaraca na kemijske insekticide17,18,19.Ovi problemi povezani s pesticidima ubrzali su potragu za učinkovitim i ekološki prihvatljivim alternativama za kontrolu prijenosnika bolesti.
Različite biljke razvijene su kao izvori fitopesticida za kontrolu štetočina20,21.Biljne tvari općenito su prihvatljive za okoliš jer su biorazgradive i imaju nisku ili zanemarivu toksičnost za neciljane organizme kao što su sisavci, ribe i vodozemci20,22.Poznato je da biljni pripravci proizvode niz bioaktivnih spojeva s različitim mehanizmima djelovanja za učinkovitu kontrolu različitih životnih stadija komaraca23,24,25,26.Spojevi biljnog podrijetla poput eteričnih ulja i drugih aktivnih biljnih sastojaka privukli su pozornost i utrli put inovativnim alatima za kontrolu vektora komaraca.Eterična ulja, monoterpeni i seskviterpeni djeluju kao repelenti, odvraćaju od hranjenja i ovicidi27,28,29,30,31,32,33.Mnoga biljna ulja uzrokuju smrt ličinki, kukuljica i odraslih komaraca34,35,36, utječući na živčani, respiratorni, endokrini i druge važne sustave insekata37.
Nedavne studije dale su uvid u potencijalnu upotrebu gorušice i njezinog sjemena kao izvora bioaktivnih spojeva.Brašno od sjemena gorušice ispitano je kao biofumigant38,39,40,41 i korišteno kao dodatak tlu za suzbijanje korova42,43,44 i kontrolu biljnih patogena koji se prenose tlom45,46,47,48,49,50, ishranu biljaka.nematode 41, 51, 52, 53, 54 i štetočine 55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicidno djelovanje ovih sjemenskih prahova pripisuje se spojevima za zaštitu biljaka koji se nazivaju izotiocijanati38,42,60.U biljkama su ti zaštitni spojevi pohranjeni u biljnim stanicama u obliku nebioaktivnih glukozinolata.Međutim, kada su biljke oštećene hranjenjem kukcima ili infekcijom patogenom, glukozinolate hidrolizira mirozinaza u bioaktivne izotiocijanate55,61.Izotiocijanati su hlapljivi spojevi za koje je poznato da imaju antimikrobno i insekticidno djelovanje širokog spektra, a njihova struktura, biološka aktivnost i sadržaj uvelike varira među vrstama Brassicaceae42,59,62,63.
Iako je poznato da izotiocijanati dobiveni iz brašna sjemena gorušice imaju insekticidno djelovanje, nedostaju podaci o biološkoj aktivnosti protiv medicinski važnih vektora člankonožaca.Naša studija ispitala je larvicidno djelovanje četiri praška od odmašćenih sjemenki protiv komaraca Aedes.Larve Aedes aegypti.Cilj istraživanja bio je procijeniti njihovu potencijalnu upotrebu kao ekološki prihvatljivih biopesticida za suzbijanje komaraca.Tri glavne kemijske komponente sjemenskog brašna, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC) također su testirane kako bi se testirala biološka aktivnost ovih kemijskih komponenti na ličinke komaraca.Ovo je prvo izvješće koje procjenjuje učinkovitost četiri praha sjemenki kupusa i njihovih glavnih kemijskih komponenti protiv ličinki komaraca.
Laboratorijske kolonije Aedes aegypti (Rockefellerov soj) održavane su na 26°C, 70% relativne vlažnosti (RH) i 10:14 h (L:D fotoperiod).Parene ženke smještene su u plastične kaveze (visine 11 cm i promjera 9,5 cm) i hranjene putem sustava za hranjenje na bočicu pomoću citrirane goveđe krvi (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, SAD).Hranjenje krvlju provedeno je kao i obično pomoću membranskog dodavača s više stakala (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, SAD) spojenog na cijev za cirkulirajuću vodenu kupelj (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, SAD) s temperaturom kontrola 37 °C.Razvucite film parafilma M na dno svake staklene komore za punjenje (površina 154 mm2).Svaka hranilica je zatim postavljena na gornju rešetku koja pokriva kavez u kojem se nalazila ženka za parenje.Približno 350-400 μl goveđe krvi dodano je u stakleni lijevak za doziranje pomoću Pasteurove pipete (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i odraslim crvima je ostavljeno da se ocijede najmanje jedan sat.Trudnim ženkama je tada dana 10% otopina saharoze i ostavljeno im je da polože jaja na vlažnom filter papiru obloženom u pojedinačne ultra prozirne čaše za soufflé (veličine 1,25 tečnih oz, Dart Container Corp., Mason, MI, SAD).kavez s vodom.Stavite filter papir koji sadrži jaja u zapečaćenu vrećicu (SC Johnsons, Racine, WI) i čuvajte na 26°C.Jaja su se izlegla i otprilike 200-250 ličinki je uzgojeno u plastičnim posudama koje su sadržavale mješavinu zečje hrane (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, SAD) i praha jetre (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, SAD).i riblji file (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Njemačka) u omjeru 2:1:1.Ličinke kasnog trećeg stadija korištene su u našim biološkim testovima.
Biljni sjemenski materijal korišten u ovoj studiji dobiven je iz sljedećih komercijalnih i državnih izvora: Brassica juncea (smeđa gorušica-Pacific Gold) i Brassica juncea (bijela gorušica-Ida Gold) iz Pacific Northwest Farmers' Cooperative, država Washington, SAD;(Garden Cress) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, SAD i Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, SAD;Niti jedno sjeme korišteno u studiji nije tretirano pesticidima.Sav sjemenski materijal je obrađen i korišten u ovoj studiji u skladu s lokalnim i nacionalnim propisima te u skladu sa svim relevantnim lokalnim državnim i nacionalnim propisima.Ovo istraživanje nije ispitivalo transgene biljne sorte.
Sjemenke Brassica juncea (PG), Lucerna (Ls), Bijela gorušica (IG), Thlaspi arvense (DFP) samljevene su u fini prah pomoću ultracentrifugalnog mlina Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Njemačka) opremljenog mrežom od 0,75 mm i nehrđajućim čelični rotor, 12 zubaca, 10 000 o/min (Tablica 1).Mljeveno sjeme u prahu je prebačeno u papirnati naprstak i odmašćeno heksanom u Soxhlet aparatu 24 sata.Poduzorak odmašćene gorušice toplinski je tretiran na 100 °C tijekom 1 sata kako bi se denaturirala mirozinaza i spriječila hidroliza glukozinolata u biološki aktivni izotiocijanat.Toplinski obrađen prah sjemena preslice (DFP-HT) korišten je kao negativna kontrola denaturiranjem mirozinaze.
Sadržaj glukozinolata u odmašćenom sjemenskom brašnu određen je u tri primjerka pomoću tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) prema prethodno objavljenom protokolu 64 .Ukratko, 3 mL metanola dodano je uzorku od 250 mg praha odmašćenog sjemena.Svaki uzorak je sonikiran u vodenoj kupelji 30 minuta i ostavljen u mraku na 23°C 16 sati.Alikvot od 1 mL organskog sloja je zatim filtriran kroz filter od 0,45 μm u autouzorkivač.Radeći na Shimadzu HPLC sustavu (dvije LC 20AD pumpe; SIL 20A autouzorkivač; DGU 20As degaser; SPD-20A UV-VIS detektor za praćenje na 237 nm; i CBM-20A modul komunikacijske sabirnice), određen je sadržaj glukozinolata u sjemenskom brašnu u tri primjerka .koristeći softver Shimadzu LC Solution verzija 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, SAD).Kolona je bila C18 Inertsil reverzno fazna kolona (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, SAD).Uvjeti početne mobilne faze postavljeni su na 12% metanola/88% 0,01 M tetrabutilamonijevog hidroksida u vodi (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) uz brzinu protoka od 1 mL/min.Nakon ubrizgavanja 15 μl uzorka, početni uvjeti su održavani 20 minuta, a zatim je omjer otapala podešen na 100% metanol, uz ukupno vrijeme analize uzorka od 65 minuta.Standardna krivulja (temeljena na nM/mAb) generirana je serijskim razrjeđenjima svježe pripremljenih standarda sinapina, glukozinolata i mirozina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) kako bi se procijenio sadržaj sumpora u odmašćenom brašnu sjemena.glukozinolati.Koncentracije glukozinolata u uzorcima testirane su na Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, SAD) korištenjem verzije OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) opremljene istom kolonom i korištenjem prethodno opisane metode.Određene su koncentracije glukozinolata;biti usporedivi između HPLC sustava.
Alil izotiocijanat (94%, stabilan) i benzil izotiocijanat (98%) kupljeni su od Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).4-Hydroxybenzylisothiocyanat je kupljen od ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).Kada se enzimatski hidrolizira mirozinazom, glukozinolati, glukozinolati i glukozinolati tvore alil izotiocijanat, benzil izotiocijanat, odnosno 4-hidroksibenzilizotiocijanat.
Laboratorijska biološka ispitivanja provedena su prema metodi Muturija i sur.32 s izmjenama.U istraživanju je korišteno pet sjemenskih krmiva s niskim udjelom masti: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls.Dvadeset ličinki stavljeno je u jednokratnu trosmjernu čašu od 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, SAD) koja sadrži 120 mL deionizirane vode (dH2O).Ispitano je sedam koncentracija sjemenskog brašna na toksičnost ličinki komaraca: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g sjemenskog brašna/120 ml dH2O za DFP brašno sjemena, DFP-HT, IG i PG.Preliminarni biološki testovi pokazuju da je odmašćeno brašno Ls sjemena toksičnije od četiri druga testirana brašna sjemena.Stoga smo prilagodili sedam tretmanskih koncentracija sačme Ls sjemena na sljedeće koncentracije: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 mL dH2O.
Netretirana kontrolna skupina (dH20, bez dodatka brašne od sjemena) uključena je za procjenu normalne smrtnosti insekata u uvjetima ispitivanja.Toksikološka biološka ispitivanja za svako brašno sjemena uključivala su tri ponavljajuće čaše s tri nagiba (20 ličinki kasnog trećeg stadija po čaši), za ukupno 108 bočica.Tretirani spremnici pohranjeni su na sobnoj temperaturi (20-21°C) i zabilježena je smrtnost ličinki tijekom 24 i 72 sata kontinuiranog izlaganja koncentracijama tretmana.Ako se tijelo i dodaci komarca ne pomiču kada se probodu ili dodirnu tankom lopaticom od nehrđajućeg čelika, ličinke komarca se smatraju mrtvima.Mrtve ličinke obično ostaju nepomične u dorzalnom ili trbušnom položaju na dnu posude ili na površini vode.Eksperiment je ponovljen tri puta u različite dane s različitim skupinama ličinki, za ukupno 180 ličinki izloženih svakoj koncentraciji tretmana.
Toksičnost AITC-a, BITC-a i 4-HBITC-a na ličinke komaraca procijenjena je korištenjem istog postupka biološkog ispitivanja, ali s različitim tretmanima.Pripremite osnovne otopine od 100 000 ppm za svaku kemikaliju dodavanjem 100 µL kemikalije u 900 µL apsolutnog etanola u 2-mL epruveti za centrifugiranje i mućkanjem 30 sekundi da se temeljito promiješa.Koncentracije za liječenje određene su na temelju naših preliminarnih bioloških ispitivanja, koja su pokazala da je BITC puno toksičniji od AITC-a i 4-HBITC-a.Za određivanje toksičnosti potrebno je 5 koncentracija BITC (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 koncentracija AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) i 6 koncentracija 4-HBITC (15 , 15, 20, 25, 30 i 35 ppm).30, 45, 60, 75 i 90 ppm).U kontrolni tretman ubrizgano je 108 μL apsolutnog etanola, što je ekvivalentno maksimalnom volumenu kemijskog tretmana.Biotestovi su ponovljeni kao gore, izlažući ukupno 180 ličinki po tretiranoj koncentraciji.Smrtnost ličinki zabilježena je za svaku koncentraciju AITC, BITC i 4-HBITC nakon 24 sata kontinuirane izloženosti.
Probit analiza 65 podataka o smrtnosti ovisnoj o dozi provedena je korištenjem Polo softvera (Polo Plus, LeOra Software, verzija 1.0) za izračunavanje 50% letalne koncentracije (LC50), 90% letalne koncentracije (LC90), nagiba, koeficijenta letalne doze i 95 % smrtonosne koncentracije.na temelju intervala pouzdanosti za omjere letalnih doza za logaritamski transformirane koncentracije i krivulje doza-smrtnost.Podaci o smrtnosti temelje se na kombiniranim podacima ponavljanja 180 ličinki izloženih svakoj koncentraciji tretmana.Probabilističke analize provedene su zasebno za svako sjemensko brašno i svaku kemijsku komponentu.Na temelju 95%-tnog intervala pouzdanosti omjera letalnih doza, toksičnost sjemenskog brašna i kemijskih sastojaka za ličinke komaraca smatra se značajno različitim, tako da interval pouzdanosti koji sadrži vrijednost 1 nije značajno različit, P = 0,0566.
Rezultati HPLC-a za određivanje glavnih glukozinolata u odmašćenom sjemenskom brašnu DFP, IG, PG i Ls navedeni su u tablici 1. Glavni glukozinolati u ispitanom sjemenskom brašnu varirali su s izuzetkom DFP-a i PG-a, koji su sadržavali glukozinolate mirozinaze.Sadržaj mirozinina u PG bio je veći nego u DFP, 33,3 ± 1,5 odnosno 26,5 ± 0,9 mg/g.Prašak sjemena Ls sadržavao je 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikona, dok je prah sjemena IG sadržavao 38,0 ± 0,5 mg/g sinapina.
Ličinke Ae.Komarci vrste Aedes aegypti ubijeni su kada su tretirani sačmom od odmašćenog sjemena, iako je učinkovitost tretmana varirala ovisno o biljnoj vrsti.Samo DFP-NT nije bio toksičan za ličinke komaraca nakon 24 i 72 sata izlaganja (Tablica 2).Toksičnost praha aktivnog sjemena povećavala se s povećanjem koncentracije (Slika 1A, B).Toksičnost sjemenskog brašna za ličinke komaraca značajno je varirala na temelju 95% CI omjera letalne doze LC50 vrijednosti pri 24-satnoj i 72-satnoj procjeni (tablica 3).Nakon 24 sata, toksični učinak sačme od sjemena Ls bio je veći od ostalih tretmana sačmom od sjemena, s najvećom aktivnošću i maksimalnom toksičnošću za ličinke (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O).Ličinke su bile manje osjetljive na DFP nakon 24 sata u usporedbi s tretmanima sjemena prahom IG, Ls i PG, s vrijednostima LC50 od 0,115, 0,04 odnosno 0,08 g/120 ml dH2O, koje su bile statistički više od vrijednosti LC50.0,211 g/120 ml dH2O (tablica 3).Vrijednosti LC90 za DFP, IG, PG i Ls bile su 0,376, 0,275, 0,137 odnosno 0,074 g/120 ml dH2O (Tablica 2).Najveća koncentracija DPP-a bila je 0,12 g/120 ml dH2O.Nakon 24 sata procjene, prosječna smrtnost ličinki bila je samo 12%, dok je prosječna smrtnost ličinki IG i PG dosegla 51%, odnosno 82%.Nakon 24 sata evaluacije, prosječna smrtnost ličinki za najvišu koncentraciju Ls obrade sjemenskog brašna (0,075 g/120 ml dH2O) bila je 99% (Slika 1A).
Krivulje mortaliteta procijenjene su iz odgovora na dozu (Probit) Ae.Egipatske ličinke (ličinke 3. stupnja) do koncentracije brašna sjemena 24 sata (A) i 72 sata (B) nakon tretmana.Isprekidana linija predstavlja LC50 tretmana sjemenskog brašna.DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Toplinski inaktiviran Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pri 72-satnoj procjeni, LC50 vrijednosti DFP, IG i PG sjemenskog brašna bile su 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O, redom.Gotovo sve ličinke izložene brašnu od Ls sjemena uginule su nakon 72 sata izlaganja, tako da podaci o smrtnosti nisu bili u skladu s Probit analizom.U usporedbi s drugim sjemenskim brašnom, ličinke su bile manje osjetljive na tretiranje DFP sjemenskim brašnom i imale su statistički više vrijednosti LC50 (Tablice 2 i 3).Nakon 72 sata, vrijednosti LC50 za DFP, IG i PG tretmane brašnom od sjemena procijenjene su na 0,111, 0,085 odnosno 0,05 g/120 ml dH2O.Nakon 72 sata evaluacije, LC90 vrijednosti DFP, IG i PG sjemena u prahu bile su 0,215, 0,254 odnosno 0,138 g/120 ml dH2O.Nakon 72 sata procjene, prosječna smrtnost ličinki za DFP, IG i PG tretman brašnom od sjemena pri maksimalnoj koncentraciji od 0,12 g/120 ml dH2O bila je 58%, 66% odnosno 96% (Slika 1B).Nakon 72-satne procjene, brašno od PG sjemena pokazalo se toksičnijim od brašna od IG i DFP sjemena.
Sintetski izotiocijanati, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC) mogu učinkovito ubiti ličinke komaraca.24 sata nakon tretmana, BITC je bio toksičniji za ličinke s vrijednošću LC50 od 5,29 ppm u usporedbi s 19,35 ppm za AITC i 55,41 ppm za 4-HBITC (Tablica 4).U usporedbi s AITC i BITC, 4-HBITC ima manju toksičnost i višu vrijednost LC50.Postoje značajne razlike u toksičnosti dvaju glavnih izotiocijanata (Ls i PG) na ličinke komaraca u najjačoj sjemenskoj brašni.Toksičnost temeljena na omjeru letalne doze LC50 vrijednosti između AITC, BITC i 4-HBITC pokazala je statističku razliku tako da 95% CI omjera letalne doze LC50 ne uključuje vrijednost 1 (P = 0,05, tablica 4).Procijenjeno je da najviše koncentracije BITC-a i AITC-a ubijaju 100% testiranih ličinki (Slika 2).
Krivulje mortaliteta procijenjene su iz odgovora na dozu (Probit) Ae.24 sata nakon tretmana, egipatske ličinke (3. stadij ličinke) postigle su koncentracije sintetskog izotiocijanata.Isprekidana linija predstavlja LC50 za tretman izotiocijanatom.Benzil izotiocijanat BITC, alil izotiocijanat AITC i 4-HBITC.
Dugo se proučavala upotreba biljnih biopesticida kao sredstava za suzbijanje vektora komaraca.Mnoge biljke proizvode prirodne kemikalije koje imaju insekticidno djelovanje37.Njihovi bioaktivni spojevi pružaju atraktivnu alternativu sintetskim insekticidima s velikim potencijalom u kontroli štetnika, uključujući komarce.
Gorušica se uzgaja kao usjev za svoje sjemenke, koristi se kao začin i izvor ulja.Kada se gorušičino ulje ekstrahira iz sjemenki ili kada se gorušica ekstrahira za upotrebu kao biogorivo, 69 nusproizvod je odmašćeno brašno od sjemena.Ovo brašno od sjemenki zadržava mnoge svoje prirodne biokemijske komponente i hidrolitičke enzime.Toksičnost ovog brašna od sjemenki pripisuje se proizvodnji izotiocijanata55,60,61.Izotiocijanati nastaju hidrolizom glukozinolata pomoću enzima mirozinaze tijekom hidratacije sjemenskog brašna38,55,70 i poznato je da imaju fungicidne, baktericidne, nematicidne i insekticidne učinke, kao i druga svojstva uključujući kemijske senzorne učinke i kemoterapijska svojstva61,62, 70.Nekoliko je studija pokazalo da biljke gorušice i brašno od sjemena djeluju učinkovito kao fumiganti protiv štetnika tla i uskladištene hrane57,59,71,72.U ovoj smo studiji procijenili toksičnost brašna od četiri sjemenke i njegova tri bioaktivna proizvoda AITC, BITC i 4-HBITC na ličinke komaraca Aedes.Aedes aegypti.Očekuje se da će dodavanje brašna od sjemena izravno u vodu koja sadrži ličinke komaraca aktivirati enzimske procese koji proizvode izotiocijanate koji su toksični za ličinke komaraca.Ova biotransformacija je djelomično dokazana uočenom larvicidnom aktivnošću brašna od sjemena i gubitkom insekticidne aktivnosti kada je brašno od sjemena patuljaste gorušice toplinski obrađeno prije upotrebe.Očekuje se da će toplinska obrada uništiti hidrolitičke enzime koji aktiviraju glukozinolate, čime se sprječava stvaranje bioaktivnih izotiocijanata.Ovo je prva studija koja potvrđuje insekticidna svojstva praha sjemenki kupusa protiv komaraca u vodenom okolišu.
Među testiranim prahom sjemena, prah sjemena potočarke (Ls) bio je najotrovniji, uzrokujući visoku smrtnost Aedes albopictus.Ličinke Aedes aegypti kontinuirano su obrađene 24 sata.Preostala tri praška sjemena (PG, IG i DFP) imala su sporiju aktivnost i još uvijek su uzrokovala značajnu smrtnost nakon 72 sata kontinuiranog tretmana.Samo Ls sjemensko brašno sadržavalo je značajne količine glukozinolata, dok su PG i DFP sadržavali mirozinazu, a IG glukozinolat kao glavni glukozinolat (Tablica 1).Glukotropaeolin se hidrolizira u BITC, a sinalbin se hidrolizira u 4-HBITC61,62.Naši rezultati biotestova pokazuju da su i Ls brašno od sjemena i sintetski BITC vrlo toksični za ličinke komaraca.Glavna komponenta PG i DFP sjemenskog brašna je mirozinaza glukozinolat, koji se hidrolizira u AITC.AITC je učinkovit u ubijanju ličinki komaraca s vrijednošću LC50 od 19,35 ppm.U usporedbi s AITC i BITC, 4-HBITC izotiocijanat je najmanje toksičan za ličinke.Iako je AITC manje toksičan od BITC-a, njihove LC50 vrijednosti niže su od mnogih eteričnih ulja testiranih na ličinkama komaraca32,73,74,75.
Naš prašak sjemena križnica za upotrebu protiv ličinki komaraca sadrži jedan glavni glukozinolat, koji čini više od 98-99% ukupnih glukozinolata utvrđenih HPLC-om.Otkrivene su količine drugih glukozinolata u tragovima, ali njihove su razine bile manje od 0,3% ukupnih glukozinolata.Prah sjemena potočarke (L. sativum) sadrži sekundarne glukozinolate (sinigrin), ali njihov udio iznosi 1% od ukupnih glukozinolata, a sadržaj im je još uvijek neznatan (oko 0,4 mg/g praha sjemena).Iako PG i DFP sadrže isti glavni glukozinolat (mirozin), larvicidna aktivnost njihovih sjemenki se značajno razlikuje zbog njihovih LC50 vrijednosti.Razlikuje se u toksičnosti prema pepelnici.Pojava ličinki Aedes aegypti može biti posljedica razlika u aktivnosti mirozinaze ili stabilnosti između dvaju izvora sjemena.Aktivnost mirozinaze igra važnu ulogu u bioraspoloživosti proizvoda hidrolize kao što su izotiocijanati u biljkama Brassicaceae76.Prethodni izvještaji Pococka i sur.77 i Wilkinsona i sur.78 pokazali su da promjene u aktivnosti i stabilnosti mirozinaze također mogu biti povezane s genetskim i okolišnim čimbenicima.
Očekivani sadržaj bioaktivnog izotiocijanata izračunat je na temelju vrijednosti LC50 svakog obroka sjemena nakon 24 i 72 sata (tablica 5) za usporedbu s odgovarajućim kemijskim primjenama.Nakon 24 sata, izotiocijanati u sjemenskom obroku bili su toksičniji od čistih spojeva.Vrijednosti LC50 izračunate na temelju dijelova na milijun (ppm) tretmana sjemena izotiocijanatom bile su niže od vrijednosti LC50 za primjene BITC, AITC i 4-HBITC.Promatrali smo ličinke kako konzumiraju pelete sjemenskog brašna (Slika 3A).Posljedično, ličinke mogu biti više koncentrirano izložene toksičnim izotiocijanatima gutanjem peleta sjemenskog brašna.To je bilo najočitije u tretmanima IG i PG sjemenskim brašnom pri 24-satnoj izloženosti, gdje su koncentracije LC50 bile 75% odnosno 72% niže od tretmana čistim AITC i 4-HBITC.Ls i DFP tretmani bili su toksičniji od čistog izotiocijanata, s LC50 vrijednostima 24% odnosno 41% nižim.Ličinke u kontrolnom tretmanu uspješno su lutkile (Slika 3B), dok većina ličinki u tretmanu sjemenskom brašnom nije lutkila i razvoj ličinki je bio značajno odgođen (Slika 3B,D).U Spodopteralituri, izotiocijanati su povezani s usporavanjem rasta i kašnjenjem u razvoju79.
Ličinke Ae.Komarci Aedes aegypti bili su kontinuirano izloženi prahu sjemenki Brassica 24-72 sata.(A) Mrtve ličinke s česticama brašna od sjemena u ustima (zaokruženo);(B) Kontrolni tretman (dH20 bez dodanog brašna od sjemena) pokazuje da ličinke normalno rastu i počinju pupati nakon 72 sata (C, D) Ličinke tretirane brašnom od sjemena;sjemensko brašno pokazalo je razlike u razvoju i nije pupiliralo.
Nismo proučavali mehanizam toksičnog djelovanja izotiocijanata na ličinke komaraca.Međutim, prethodne studije na crvenim vatrenim mravima (Solenopsis invicta) pokazale su da je inhibicija glutation S-transferaze (GST) i esteraze (EST) glavni mehanizam bioaktivnosti izotiocijanata, a AITC, čak i pri niskoj aktivnosti, također može inhibirati aktivnost GST .crveni uvozni vatreni mravi u niskim koncentracijama.Doza je 0,5 µg/ml80.Nasuprot tome, AITC inhibira acetilkolinesterazu kod odraslih kukuruznih žižaka (Sitophilus zeamais)81.Slična istraživanja moraju se provesti kako bi se razjasnio mehanizam djelovanja izotiocijanata u ličinkama komaraca.
Koristimo toplinski inaktivirani DFP tretman kako bismo podržali prijedlog da hidroliza biljnih glukozinolata u reaktivne izotiocijanate služi kao mehanizam za kontrolu ličinki komaraca brašnom od sjemenki gorušice.Sačma DFP-HT sjemena nije bila toksična pri testiranim količinama primjene.Lafarga i sur.82 izvijestio je da su glukozinolati osjetljivi na razgradnju pri visokim temperaturama.Očekuje se da će toplinska obrada denaturirati enzim mirozinazu u brašnu od sjemena i spriječiti hidrolizu glukozinolata da bi se formirali reaktivni izotiocijanati.To su također potvrdili Okunade et al.75 pokazalo je da je mirozinaza osjetljiva na temperaturu, pokazujući da je aktivnost mirozinaze potpuno deaktivirana kada su sjemenke gorušice, crne gorušice i krvavog korijena bile izložene temperaturama iznad 80°.C. Ovi mehanizmi mogu rezultirati gubitkom insekticidne aktivnosti toplinski obrađenog DFP sjemenskog brašna.
Stoga su brašno od sjemena gorušice i njegova tri glavna izotiocijanata otrovni za ličinke komaraca.S obzirom na ove razlike između brašna od sjemena i kemijskih tretmana, korištenje brašna od sjemena može biti učinkovita metoda kontrole komaraca.Postoji potreba da se identificiraju prikladne formulacije i učinkoviti sustavi za isporuku kako bi se poboljšala učinkovitost i stabilnost upotrebe sjemenskih prahova.Naši rezultati ukazuju na potencijalnu upotrebu brašna od sjemenki gorušice kao alternative sintetskim pesticidima.Ova bi tehnologija mogla postati inovativan alat za kontrolu vektora komaraca.Budući da se ličinke komaraca razvijaju u vodenom okolišu, a glukozinolati sjemena sjemena enzimski se pretvaraju u aktivne izotiocijanate nakon hidratacije, uporaba obroka sjemenki gorušice u vodi u kojoj su napadnuti komarci nudi značajan potencijal kontrole.Iako larvicidna aktivnost izotiocijanata varira (BITC > AITC > 4-HBITC), potrebno je više istraživanja kako bi se utvrdilo povećava li kombinacija brašna od sjemenki s više glukozinolata sinergistički toksičnost.Ovo je prva studija koja je pokazala insekticidne učinke brašna od odmašćenih sjemenki krstašica i tri bioaktivna izotiocijanata na komarce.Rezultati ove studije postavljaju nove temelje pokazujući da odmašćeno brašno sjemenki kupusa, nusprodukt ekstrakcije ulja iz sjemenki, može poslužiti kao obećavajuće larvicidno sredstvo za kontrolu komaraca.Ove informacije mogu pomoći u daljnjem otkrivanju sredstava za biokontrolu biljaka i njihovom razvoju kao jeftinih, praktičnih i ekološki prihvatljivih biopesticida.
Skupovi podataka generirani za ovu studiju i rezultirajuće analize dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.Na kraju istraživanja, svi materijali korišteni u istraživanju (insekti i sjemensko brašno) su uništeni.
Vrijeme objave: 29. srpnja 2024