Učinkovitosuzbijanje komaracai smanjiti učestalost bolesti koje prenose, potrebne su strateške, održive i ekološki prihvatljive alternative kemijskim pesticidima. Procijenili smo sjemensku sačmu određenih Brassicaceae (porodica Brassica) kao izvor izotiocijanata biljnog podrijetla proizvedenih enzimskom hidrolizom biološki neaktivnih glukozinolata za upotrebu u kontroli egipatske vrste Aedes (L., 1762). Petostruko odmašćena sjemenska sačma (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – tri glavne vrste toplinske inaktivacije i enzimske razgradnje Kemijski proizvodi Za određivanje toksičnosti (LC50) alil izotiocijanata, benzil izotiocijanata i 4-hidroksibenzilizotiocijanata za ličinke Aedes aegypti pri 24-satnoj izloženosti = 0,04 g/120 ml dH2O). Vrijednosti LC50 za sjemenski obrok gorušice, bijele gorušice i preslice bile su 0,05, 0,08 i 0,05 u usporedbi s alil izotiocijanatom (LC50 = 19,35 ppm) i 4,2-hidroksibenzilizotiocijanat (LC50 = 55,41 ppm) bio je toksičniji za ličinke 24 sata nakon tretmana od 0,1 g/120 ml dH2O. Ovi rezultati su u skladu s proizvodnjom sjemenskog obroka lucerne. Veća učinkovitost benzil estera odgovara izračunatim vrijednostima LC50. Korištenje sjemenskog obroka može pružiti učinkovitu metodu suzbijanja komaraca. Učinkovitost praha sjemena krupicnjače i njegovih glavnih kemijskih sastojaka protiv ličinki komaraca pokazuje kako prirodni spojevi u prahu sjemena krupicnjače mogu poslužiti kao obećavajući ekološki prihvatljiv larvicid za suzbijanje komaraca.
Vektorske bolesti uzrokovane komarcima Aedes ostaju glavni globalni javnozdravstveni problem. Učestalost bolesti koje prenose komarci širi se geografski1,2,3 i ponovno se pojavljuje, što dovodi do izbijanja teških bolesti4,5,6,7. Širenje bolesti među ljudima i životinjama (npr. čikungunja, denga groznica, groznica Rift Valleyja, žuta groznica i virus Zika) je neviđeno. Samo denga groznica dovodi otprilike 3,6 milijardi ljudi u rizik od infekcije u tropima, s procijenjenih 390 milijuna infekcija godišnje, što rezultira s 6100–24 300 smrtnih slučajeva godišnje8. Ponovna pojava i izbijanje virusa Zika u Južnoj Americi privukli su pozornost cijelog svijeta zbog oštećenja mozga koje uzrokuje kod djece rođene od zaraženih žena2. Kremer i suradnici3 predviđaju da će se geografski raspon komaraca Aedes nastaviti širiti i da će do 2050. polovica svjetske populacije biti u riziku od infekcije arbovirusima koje prenose komarci.
Uz iznimku nedavno razvijenih cjepiva protiv denge i žute groznice, cjepiva protiv većine bolesti koje prenose komarci još nisu razvijena9,10,11. Cjepiva su još uvijek dostupna u ograničenim količinama i koriste se samo u kliničkim ispitivanjima. Suzbijanje vektora komaraca pomoću sintetičkih insekticida bila je ključna strategija za kontrolu širenja bolesti koje prenose komarci12,13. Iako su sintetički pesticidi učinkoviti u ubijanju komaraca, kontinuirana upotreba sintetičkih pesticida negativno utječe na organizme koji nisu ciljna skupina i zagađuje okoliš14,15,16. Još je alarmantniji trend povećanja otpornosti komaraca na kemijske insekticide17,18,19. Ovi problemi povezani s pesticidima ubrzali su potragu za učinkovitim i ekološki prihvatljivim alternativama za suzbijanje vektora bolesti.
Različite biljke razvijene su kao izvori fitopesticida za suzbijanje štetočina20,21. Biljne tvari općenito su ekološki prihvatljive jer su biorazgradive i imaju nisku ili zanemarivu toksičnost za organizme koji nisu ciljna skupina poput sisavaca, riba i vodozemaca20,22. Poznato je da biljni pripravci proizvode razne bioaktivne spojeve s različitim mehanizmima djelovanja kako bi učinkovito kontrolirali različite životne faze komaraca23,24,25,26. Spojevi biljnog podrijetla poput eteričnih ulja i drugih aktivnih biljnih sastojaka privukli su pozornost i utrli put inovativnim alatima za suzbijanje vektora komaraca. Eterična ulja, monoterpeni i seskviterpeni djeluju kao repelenti, sredstva za odvraćanje hranjenja i ovicidi27,28,29,30,31,32,33. Mnoga biljna ulja uzrokuju smrt ličinki, kukuljica i odraslih komaraca34,35,36, utječući na živčani, dišni, endokrini i druge važne sustave insekata37.
Nedavne studije pružile su uvid u potencijalnu upotrebu biljaka gorušice i njihovih sjemenki kao izvora bioaktivnih spojeva. Brašno od sjemenki gorušice testirano je kao biofumigant38,39,40,41 i korišteno kao dodatak tlu za suzbijanje korova42,43,44 i kontrolu biljnih patogena koji se prenose tlom45,46,47,48,49,50, prehranu biljaka, nematode 41,51, 52, 53, 54 i štetnike 55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicidno djelovanje ovih prahova sjemena pripisuje se spojevima za zaštitu biljaka koji se nazivaju izotiocijanati38,42,60. U biljkama se ovi zaštitni spojevi pohranjuju u biljnim stanicama u obliku nebioaktivnih glukozinolata. Međutim, kada su biljke oštećene hranjenjem insektima ili infekcijom patogenima, glukozinolati se hidroliziraju mirozinazom u bioaktivne izotiocijanate55,61. Izotiocijanati su hlapljivi spojevi poznati po širokom spektru antimikrobnog i insekticidnog djelovanja, a njihova struktura, biološka aktivnost i sadržaj uvelike variraju među vrstama Brassicaceae42,59,62,63.
Iako je poznato da izotiocijanati dobiveni iz brašna sjemenki gorušice imaju insekticidno djelovanje, nedostaju podaci o biološkoj aktivnosti protiv medicinski važnih vektora člankonožaca. Naša studija ispitala je larvicidno djelovanje četiri odmašćena praha sjemenki protiv komaraca Aedes. Ličinke Aedes aegypti. Cilj studije bio je procijeniti njihovu potencijalnu upotrebu kao ekološki prihvatljivih biopesticida za suzbijanje komaraca. Tri glavne kemijske komponente brašna sjemenki, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC), također su testirane kako bi se testirala biološka aktivnost ovih kemijskih komponenti na ličinke komaraca. Ovo je prvo izvješće koje procjenjuje učinkovitost četiri praha sjemenki kupusa i njihovih glavnih kemijskih komponenti protiv ličinki komaraca.
Laboratorijske kolonije Aedes aegypti (soj Rockefeller) održavane su na 26°C, 70% relativne vlažnosti (RH) i 10:14 h (fotoperiod L:D). Parene ženke smještene su u plastične kaveze (visine 11 cm i promjera 9,5 cm) i hranjene putem sustava za hranjenje na bočicu koristeći citratiranu goveđu krv (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, SAD). Hranjenje krvlju provedeno je kao i obično pomoću membranske višestaklene hranilice (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, SAD) spojene na cijev za cirkulacijsku vodenu kupelj (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, SAD) s kontrolom temperature od 37°C. Na dno svake staklene komore za hranjenje (površina 154 mm2) rastegnuti je film Parafilma M. Svaka hranilica zatim je postavljena na gornju rešetku koja prekriva kavez u kojem se nalazila ženka koja se parila. Otprilike 350–400 μl goveđe krvi dodano je u stakleni lijevak za hranjenje pomoću Pasteurove pipete (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i odrasli crvi su ostavljeni da se ocijede najmanje jedan sat. Gravidnim ženkama je zatim dana 10%-tna otopina saharoze i ostavljeno im je da polože jaja na vlažni filter papir obložen u pojedinačne ultra prozirne čašice za sufle (veličine 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, SAD). Filter papir s jajima stavite u zatvorenu vrećicu (SC Johnsons, Racine, WI) i pohranite na 26°C. Jaja su se izlegla i otprilike 200–250 ličinki uzgojeno je u plastičnim posudama koje su sadržavale mješavinu hrane za kuniće (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, SAD) i praha jetre (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, SAD) te ribljeg fileta (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Njemačka) u omjeru 2:1:1. U našim biološkim testovima korištene su ličinke kasnog trećeg stadija.
Sjemenski materijal biljaka korišten u ovoj studiji dobiven je iz sljedećih komercijalnih i vladinih izvora: Brassica juncea (smeđa gorušica - Pacific Gold) i Brassica juncea (bijela gorušica - Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, država Washington, SAD; (vrtna potočarka) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, SAD i Thlaspi arvense (poljska potočarka - Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, SAD; Niti jedno sjeme korišteno u studiji nije tretirano pesticidima. Sav sjemenski materijal obrađen je i korišten u ovoj studiji u skladu s lokalnim i nacionalnim propisima te u skladu sa svim relevantnim lokalnim, državnim i nacionalnim propisima. Ova studija nije ispitivala transgene biljne sorte.
Sjemenke Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Bijela gorušica (IG) i Thlaspi arvense (DFP) samljevene su u fini prah pomoću ultracentrifugalnog mlina Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Njemačka) opremljenog rupicama od 0,75 mm i rotorom od nehrđajućeg čelika, 12 zubaca, 10 000 okretaja u minuti (Tablica 1). Prašak mljevenog sjemena prebačen je u papirnatu posudu i odmašćen heksanom u Soxhlet aparatu tijekom 24 sata. Poduzorak odmašćene poljske gorušice toplinski je obrađen na 100 °C tijekom 1 sata kako bi se denaturirala mirozinaza i spriječila hidroliza glukozinolata u stvaranje biološki aktivnih izotiocijanata. Toplinski obrađeni prah sjemena preslice (DFP-HT) korišten je kao negativna kontrola denaturacijom mirozinaze.
Sadržaj glukozinolata u obranom sjemenskom brašnu određen je u tri primjerka pomoću visokoučinkovite tekućinske kromatografije (HPLC) prema prethodno objavljenom protokolu 64. Ukratko, 3 mL metanola dodano je u uzorak od 250 mg obranog sjemenskog praha. Svaki uzorak je soniciran u vodenoj kupelji 30 minuta i ostavljen u mraku na 23°C tijekom 16 sati. Alikvot od 1 mL organskog sloja zatim je filtriran kroz filter od 0,45 μm u automatski uzorkivač. Radeći na Shimadzu HPLC sustavu (dvije LC 20AD pumpe; automatski uzorkivač SIL 20A; degazator DGU 20As; UV-VIS detektor SPD-20A za praćenje na 237 nm; i komunikacijski sabirnički modul CBM-20A), sadržaj glukozinolata u sjemenskom brašnu određen je u tri primjerka pomoću Shimadzu LC Solution softvera verzije 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, SAD). Kolona je bila C18 Inertsil kolona reverzne faze (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, SAD). Početni uvjeti mobilne faze postavljeni su na 12% metanola/88% 0,01 M tetrabutilamonijevog hidroksida u vodi (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) s brzinom protoka od 1 mL/min. Nakon injektiranja 15 μl uzorka, početni uvjeti održavani su 20 minuta, a zatim je omjer otapala podešen na 100% metanola, s ukupnim vremenom analize uzorka od 65 minuta. Standardna krivulja (na bazi nM/mAb) generirana je serijskim razrjeđenjima svježe pripremljenih standarda sinapina, glukozinolata i mirozina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) kako bi se procijenio sadržaj sumpora u odmašćenom sjemenskom brašnu glukozinolata. Koncentracije glukozinolata u uzorcima testirane su na Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, SAD) korištenjem OpenLAB CDS ChemStation verzije (C.01.07 SR2 [255]) opremljene istom kolonom i korištenjem prethodno opisane metode. Koncentracije glukozinolata određene su; biti usporedive između HPLC sustava.
Alil izotiocijanat (94%, stabilan) i benzil izotiocijanat (98%) kupljeni su od tvrtke Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). 4-Hidroksibenzilizotiocijanat kupljen je od tvrtke ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, SAD). Kada ih mirozinaza enzimski hidrolizira, glukozinolati, glukozinolati i glukozinolati tvore alil izotiocijanat, benzil izotiocijanat i 4-hidroksibenzilizotiocijanat.
Laboratorijski biološki testovi provedeni su prema metodi Muturija i suradnika 32 s modifikacijama. U studiji je korišteno pet vrsta sjemenske hrane s niskim udjelom masti: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls. Dvadeset ličinki stavljeno je u jednokratnu čašu s tri smjera od 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, SAD) koja je sadržavala 120 mL deionizirane vode (dH2O). Sedam koncentracija sjemenskog brašna testirano je na toksičnost za ličinke komaraca: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g sjemenskog brašna/120 ml dH2O za sjemensko brašno DFP, DFP-HT, IG i PG. Preliminarni biološki testovi pokazuju da je obezmašćeno sjemensko brašno Ls toksičnije od četiri druga testirana sjemenska brašna. Stoga smo prilagodili sedam koncentracija tretmana sjemenskog brašna Ls na sljedeće koncentracije: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 mL dH2O.
Netretirana kontrolna skupina (dH20, bez dodatka sjemenskog brašna) uključena je kako bi se procijenila normalna smrtnost insekata u uvjetima ispitivanja. Toksikološki biološki testovi za svaki sjemenski obrok uključivali su tri ponovljena čašice s tri nagiba (20 ličinki kasnog trećeg stadija po čašici), za ukupno 108 bočica. Tretirane posude pohranjene su na sobnoj temperaturi (20-21°C), a smrtnost ličinki zabilježena je tijekom 24 i 72 sata kontinuiranog izlaganja koncentracijama tretmana. Ako se tijelo i dodaci komarca ne pomiču kada se probuše ili dodirnu tankom lopaticom od nehrđajućeg čelika, ličinke komaraca smatraju se mrtvima. Mrtve ličinke obično ostaju nepomične u dorzalnom ili ventralnom položaju na dnu posude ili na površini vode. Pokus je ponovljen tri puta u različitim danima koristeći različite skupine ličinki, za ukupno 180 ličinki izloženih svakoj koncentraciji tretmana.
Toksičnost AITC-a, BITC-a i 4-HBITC-a za ličinke komaraca procijenjena je istim postupkom biološkog ispitivanja, ali s različitim tretmanima. Pripremite osnovne otopine od 100 000 ppm za svaku kemikaliju dodavanjem 100 µL kemikalije u 900 µL apsolutnog etanola u epruveti za centrifugiranje od 2 mL i protresanjem 30 sekundi kako bi se dobro promiješalo. Koncentracije tretmana određene su na temelju naših preliminarnih bioloških ispitivanja, koja su pokazala da je BITC mnogo toksičniji od AITC-a i 4-HBITC-a. Za određivanje toksičnosti korišteno je 5 koncentracija BITC-a (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 koncentracija AITC-a (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) i 6 koncentracija 4-HBITC-a (15, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm, odnosno 30, 45, 60, 75 i 90 ppm). Kontrolnom tretmanu ubrizgano je 108 μL apsolutnog etanola, što je ekvivalentno maksimalnom volumenu kemijskog tretmana. Biološki testovi su ponovljeni kao gore, izlažući ukupno 180 ličinki po koncentraciji tretmana. Mortalitet ličinki zabilježen je za svaku koncentraciju AITC-a, BITC-a i 4-HBITC-a nakon 24 sata kontinuirane izloženosti.
Probit analiza 65 podataka o smrtnosti povezanih s dozom provedena je pomoću Polo softvera (Polo Plus, LeOra Software, verzija 1.0) za izračun 50%-tne smrtonosne koncentracije (LC50), 90%-tne smrtonosne koncentracije (LC90), nagiba, koeficijenta smrtonosne doze i 95%-tne smrtonosne koncentracije, na temelju intervala pouzdanosti za omjere smrtonosnih doza za logaritamski transformirane krivulje koncentracije i krivulje smrtnosti doze. Podaci o smrtnosti temelje se na kombiniranim ponovljenim podacima 180 ličinki izloženih svakoj koncentraciji tretmana. Probabilističke analize provedene su zasebno za svaki obrok sjemena i svaku kemijsku komponentu. Na temelju 95%-tnog intervala pouzdanosti omjera smrtonosne doze, toksičnost obroka sjemena i kemijskih sastojaka za ličinke komaraca smatrana je značajno različitom, tako da interval pouzdanosti koji sadrži vrijednost 1 nije bio značajno drugačiji, P = 0,0566.
Rezultati HPLC-a za određivanje glavnih glukozinolata u obranom brašnu sjemenki DFP, IG, PG i Ls navedeni su u Tablici 1. Glavni glukozinolati u testiranom brašnu sjemenki varirali su, s izuzetkom DFP-a i PG-a, koji su oba sadržavali mirozinazne glukozinolate. Sadržaj mirozinina u PG-u bio je veći nego u DFP-u, 33,3 ± 1,5 odnosno 26,5 ± 0,9 mg/g. Prašak sjemenki Ls sadržavao je 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikona, dok je prah sjemenki IG sadržavao 38,0 ± 0,5 mg/g sinapina.
Ličinke komaraca *Ae. Aedes aegypti* ubijene su tretiranjem odmašćenim sjemenskim brašnom, iako je učinkovitost tretmana varirala ovisno o biljnoj vrsti. Samo DFP-NT nije bio toksičan za ličinke komaraca nakon 24 i 72 sata izloženosti (Tablica 2). Toksičnost aktivnog sjemenskog praha povećavala se s povećanjem koncentracije (Slika 1A, B). Toksičnost sjemenskog brašna za ličinke komaraca značajno se razlikovala na temelju 95%-tnog intervala pouzdanosti omjera letalne doze LC50 vrijednosti pri 24-satnim i 72-satnim procjenama (Tablica 3). Nakon 24 sata, toksični učinak sjemenskog brašna *Ls* bio je veći od drugih tretmana sjemenskim brašnom, s najvećom aktivnošću i maksimalnom toksičnošću za ličinke (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Ličinke su bile manje osjetljive na DFP nakon 24 sata u usporedbi s tretmanima sjemenskim prahom IG, Ls i PG, s vrijednostima LC50 od 0,115, 0,04 i 0,08 g/120 ml dH2O, respektivno, što je bilo statistički više od vrijednosti LC50 od 0,211 g/120 ml dH2O (Tablica 3). Vrijednosti LC90 DFP, IG, PG i Ls bile su 0,376, 0,275, 0,137 i 0,074 g/120 ml dH2O (Tablica 2). Najviša koncentracija DPP bila je 0,12 g/120 ml dH2O. Nakon 24 sata procjene, prosječna smrtnost ličinki bila je samo 12%, dok je prosječna smrtnost ličinki IG i PG dosegla 51% odnosno 82%. Nakon 24 sata procjene, prosječna smrtnost ličinki za tretman sjemenskom sačmom Ls s najvišom koncentracijom (0,075 g/120 ml dH2O) bila je 99% (slika 1A).
Krivulje smrtnosti procijenjene su iz odgovora na dozu (Probit) ličinki Ae. Egyptian (ličinke 3. instara) na koncentraciju sjemenskog brašna 24 sata (A) i 72 sata (B) nakon tretmana. Isprekidana linija predstavlja LC50 tretmana sjemenskim brašnom. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Toplinom inaktivirani Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pri 72-satnoj evaluaciji, vrijednosti LC50 sjemenskog brašna DFP, IG i PG bile su 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O. Gotovo sve ličinke izložene sjemenskom brašnu Ls uginule su nakon 72 sata izloženosti, tako da podaci o smrtnosti nisu bili u skladu s Probit analizom. U usporedbi s drugim sjemenskim brašnom, ličinke su bile manje osjetljive na tretman sjemenskim brašnom DFP i imale su statistički više LC50 vrijednosti (Tablice 2 i 3). Nakon 72 sata, vrijednosti LC50 za tretmane sjemenskim brašnom DFP, IG i PG procijenjene su na 0,111, 0,085 i 0,05 g/120 ml dH2O. Nakon 72 sata evaluacije, vrijednosti LC90 sjemenskog praha DFP, IG i PG bile su 0,215, 0,254 i 0,138 g/120 ml dH2O. Nakon 72 sata evaluacije, prosječna smrtnost ličinki za tretmane sjemenskim brašnom DFP, IG i PG pri maksimalnoj koncentraciji od 0,12 g/120 ml dH2O bila je 58%, 66% odnosno 96% (slika 1B). Nakon 72-satne evaluacije, utvrđeno je da je sjemensko brašno PG toksičnije od sjemenskog brašna IG i DFP.
Sintetski izotiocijanati, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC) mogu učinkovito ubiti ličinke komaraca. 24 sata nakon tretmana, BITC je bio toksičniji za ličinke s LC50 vrijednošću od 5,29 ppm u usporedbi s 19,35 ppm za AITC i 55,41 ppm za 4-HBITC (Tablica 4). U usporedbi s AITC i BITC, 4-HBITC ima nižu toksičnost i višu LC50 vrijednost. Postoje značajne razlike u toksičnosti dva glavna izotiocijanata (Ls i PG) za ličinke komaraca u najpotentnijoj sjemenskoj sačmi. Toksičnost temeljena na omjeru letalne doze LC50 vrijednosti između AITC, BITC i 4-HBITC pokazala je statističku razliku tako da 95% CI omjera letalne doze LC50 nije uključivao vrijednost od 1 (P = 0,05, Tablica 4). Procijenjeno je da najviše koncentracije BITC-a i AITC-a ubijaju 100% testiranih ličinki (Slika 2).
Krivulje smrtnosti procijenjene su iz odgovora na dozu (Probit) Ae. 24 sata nakon tretmana, egipatske ličinke (ličinke 3. instara) dosegle su koncentracije sintetskog izotiocijanata. Isprekidana linija predstavlja LC50 za tretman izotiocijanatom. Benzil izotiocijanat BITC, alil izotiocijanat AITC i 4-HBITC.
Upotreba biljnih biopesticida kao sredstava za suzbijanje komaraca vektora dugo se proučava. Mnoge biljke proizvode prirodne kemikalije koje imaju insekticidno djelovanje37. Njihovi bioaktivni spojevi pružaju atraktivnu alternativu sintetičkim insekticidima s velikim potencijalom u suzbijanju štetnika, uključujući komarce.
Biljke gorušice uzgajaju se kao kultura zbog sjemena, koriste se kao začin i izvor ulja. Kada se ulje gorušice ekstrahira iz sjemena ili kada se gorušica ekstrahira za upotrebu kao biogorivo, 69 nusproizvod je odmašćeno sjemensko brašno. Ovo sjemensko brašno zadržava mnoge svoje prirodne biokemijske komponente i hidrolitičke enzime. Toksičnost ovog sjemenskog brašna pripisuje se proizvodnji izotiocijanata55,60,61. Izotiocijanati nastaju hidrolizom glukozinolata enzimom mirozinazom tijekom hidratacije sjemenskog brašna38,55,70 i poznato je da imaju fungicidne, baktericidne, nematocidne i insekticidne učinke, kao i druga svojstva, uključujući kemijske senzorne učinke i kemoterapijska svojstva61,62,70. Nekoliko studija pokazalo je da biljke gorušice i sjemensko brašno učinkovito djeluju kao fumiganti protiv štetnika u tlu i uskladištene hrane57,59,71,72. U ovoj studiji procijenili smo toksičnost sačme od četiri sjemenke i njegova tri bioaktivna produkta AITC, BITC i 4-HBITC za ličinke komaraca Aedes. Aedes aegypti. Očekuje se da će dodavanje sačme izravno u vodu koja sadrži ličinke komaraca aktivirati enzimske procese koji proizvode izotiocijanate koji su toksični za ličinke komaraca. Ova biotransformacija djelomično je dokazana uočenom larvicidnom aktivnošću sačme i gubitkom insekticidne aktivnosti kada je sačma patuljaste gorušice toplinski obrađena prije upotrebe. Očekuje se da će toplinska obrada uništiti hidrolitičke enzime koji aktiviraju glukozinolate, čime se sprječava stvaranje bioaktivnih izotiocijanata. Ovo je prva studija koja potvrđuje insekticidna svojstva praha sjemenki kupusa protiv komaraca u vodenom okruženju.
Među testiranim sjemenskim prahom, prah sjemenki potočarke (Ls) bio je najtoksičniji, uzrokujući visoku smrtnost Aedes albopictus. Ličinke Aedes aegypti kontinuirano su obrađivane 24 sata. Preostala tri sjemenska praha (PG, IG i DFP) imala su sporiju aktivnost i još uvijek su uzrokovala značajnu smrtnost nakon 72 sata kontinuiranog tretmana. Samo je sjemenska sačma Ls sadržavala značajne količine glukozinolata, dok su PG i DFP sadržavali mirozinazu, a IG glukozinolat kao glavni glukozinolat (Tablica 1). Glukotropaeolin se hidrolizira u BITC, a sinalbin se hidrolizira u 4-HBITC61,62. Naši rezultati biološkog testa pokazuju da su i sjemenska sačma Ls i sintetski BITC vrlo toksični za ličinke komaraca. Glavna komponenta sjemenske sačme PG i DFP je mirozinaza glukozinolat, koji se hidrolizira u AITC. AITC je učinkovit u ubijanju ličinki komaraca s LC50 vrijednošću od 19,35 ppm. U usporedbi s AITC-om i BITC-om, 4-HBITC izotiocijanat je najmanje toksičan za ličinke. Iako je AITC manje toksičan od BITC-a, njihove LC50 vrijednosti su niže od mnogih eteričnih ulja testiranih na ličinkama komaraca32,73,74,75.
Naš prah sjemena krstašica za upotrebu protiv ličinki komaraca sadrži jedan glavni glukozinolat, koji čini preko 98-99% ukupnih glukozinolata, određeno HPLC-om. Otkrivene su tragove drugih glukozinolata, ali njihove su razine bile manje od 0,3% ukupnih glukozinolata. Prah sjemena potočarke (L. sativum) sadrži sekundarne glukozinolate (sinigrin), ali njihov udio je 1% ukupnih glukozinolata, a njihov sadržaj je još uvijek beznačajan (oko 0,4 mg/g praha sjemena). Iako PG i DFP sadrže isti glavni glukozinolat (mirozin), larvicidna aktivnost njihovih sjemenskih obroka značajno se razlikuje zbog njihovih LC50 vrijednosti. Varira u toksičnosti za pepelnicu. Pojava ličinki Aedes aegypti može biti posljedica razlika u aktivnosti mirozinaze ili stabilnosti između dva obroka sjemena. Aktivnost mirozinaze igra važnu ulogu u bioraspoloživosti produkata hidrolize poput izotiocijanata u biljkama Brassicaceae76. Prethodna izvješća Pococka i sur.77 te Wilkinsona i sur.78 pokazala su da promjene u aktivnosti i stabilnosti mirozinaze mogu biti povezane i s genetskim i okolišnim čimbenicima.
Očekivani sadržaj bioaktivnih izotiocijanata izračunat je na temelju LC50 vrijednosti svakog sjemenskog obroka nakon 24 i 72 sata (Tablica 5) radi usporedbe s odgovarajućim kemijskim primjenama. Nakon 24 sata, izotiocijanati u sjemenskom obroku bili su toksičniji od čistih spojeva. Vrijednosti LC50 izračunate na temelju dijelova na milijun (ppm) tretmana sjemena izotiocijanatom bile su niže od vrijednosti LC50 za primjene BITC-a, AITC-a i 4-HBITC-a. Promatrali smo ličinke koje konzumiraju pelete sjemenskog obroka (Slika 3A). Posljedično, ličinke mogu biti koncentriranije izložene toksičnim izotiocijanatima gutanjem peleta sjemenskog obroka. To je bilo najočitije u tretmanima sjemenskog obroka IG i PG pri 24-satnoj izloženosti, gdje su koncentracije LC50 bile 75% odnosno 72% niže od tretmana čistim AITC-om i 4-HBITC-om. Tretmani Ls i DFP bili su toksičniji od čistog izotiocijanata, s vrijednostima LC50 nižim za 24% odnosno 41%. Ličinke u kontrolnom tretmanu uspješno su se kukuljile (slika 3B), dok se većina ličinki u tretmanu sjemenskim brašnom nije kukuljila, a razvoj ličinki je značajno odgođen (slika 3B,D). Kod Spodopteraliture, izotiocijanati su povezani s usporavanjem rasta i razvojnim kašnjenjem79.
Ličinke komaraca *Ae. Aedes aegypti* bile su kontinuirano izložene prahu sjemena *Brassica* tijekom 24-72 sata. (A) Mrtve ličinke s česticama sjemenskog brašna u ustima (zaokruženo); (B) Kontrolni tretman (dH20 bez dodanog sjemenskog brašna) pokazuje da ličinke normalno rastu i počinju se kukuljiti nakon 72 sata (C, D) Ličinke tretirane sjemenskim brašnom; sjemensko brašno pokazalo je razlike u razvoju i nije se kukuljilo.
Nismo proučavali mehanizam toksičnih učinaka izotiocijanata na ličinke komaraca. Međutim, prethodne studije na crvenim vatrenim mravima (Solenopsis invicta) pokazale su da je inhibicija glutation S-transferaze (GST) i esteraze (EST) glavni mehanizam bioaktivnosti izotiocijanata, a AITC, čak i pri niskoj aktivnosti, također može inhibirati aktivnost GST-a. crveni uvezeni vatreni mravi u niskim koncentracijama. Doza je 0,5 µg/ml80. Nasuprot tome, AITC inhibira acetilkolinesterazu u odraslim kukuruznim žižcima (Sitophilus zeamais)81. Slična istraživanja moraju se provesti kako bi se razjasnio mehanizam aktivnosti izotiocijanata u ličinkama komaraca.
Koristimo tretman DFP-a inaktiviranim toplinom kako bismo podržali prijedlog da hidroliza biljnih glukozinolata u stvaranje reaktivnih izotiocijanata služi kao mehanizam za suzbijanje ličinki komaraca pomoću sačme sjemenki gorušice. DFP-HT sačma sjemena nije bila toksična pri testiranim količinama primjene. Lafarga i sur. 82 izvijestili su da su glukozinolati osjetljivi na razgradnju na visokim temperaturama. Očekuje se da će toplinska obrada također denaturirati enzim mirozinazu u sačmi sjemena i spriječiti hidrolizu glukozinolata u stvaranje reaktivnih izotiocijanata. To su također potvrdili Okunade i sur. 75 koji su pokazali da je mirozinaza osjetljiva na temperaturu, pokazujući da je aktivnost mirozinaze potpuno inaktivirana kada su sjemenke gorušice, crne gorušice i krvavog korijena bile izložene temperaturama iznad 80°C. Ovi mehanizmi mogu rezultirati gubitkom insekticidne aktivnosti toplinski tretirane sačme sjemena DFP.
Dakle, brašno od sjemenki gorušice i njegova tri glavna izotiocijanata toksični su za ličinke komaraca. S obzirom na ove razlike između brašna od sjemenki i kemijskih tretmana, upotreba brašna od sjemenki gorušice može biti učinkovita metoda suzbijanja komaraca. Potrebno je identificirati prikladne formulacije i učinkovite sustave isporuke kako bi se poboljšala učinkovitost i stabilnost upotrebe praha sjemena. Naši rezultati ukazuju na potencijalnu upotrebu brašna od sjemenki gorušice kao alternative sintetičkim pesticidima. Ova tehnologija mogla bi postati inovativan alat za suzbijanje vektora komaraca. Budući da ličinke komaraca uspijevaju u vodenim okruženjima, a glukozinolati iz brašna od sjemenki gorušice enzimski se pretvaraju u aktivne izotiocijanate nakon hidratacije, upotreba brašna od sjemenki gorušice u vodi zaraženoj komarcima nudi značajan potencijal suzbijanja. Iako larvicidna aktivnost izotiocijanata varira (BITC > AITC > 4-HBITC), potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo povećava li kombiniranje brašna od sjemenki gorušice s više glukozinolata sinergistički toksičnost. Ovo je prva studija koja pokazuje insekticidne učinke obezmašćenog brašna od sjemenki križarica i tri bioaktivna izotiocijanata na komarce. Rezultati ove studije otvaraju nove puteve pokazujući da obrano brašno od sjemenki kupusa, nusprodukt ekstrakcije ulja iz sjemenki, može poslužiti kao obećavajuće larvicidno sredstvo za suzbijanje komaraca. Ove informacije mogu pomoći u daljnjem otkrivanju sredstava za biokontrolu biljaka i njihovom razvoju kao jeftinih, praktičnih i ekološki prihvatljivih biopesticida.
Skupovi podataka generirani za ovu studiju i rezultirajuće analize dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev. Na kraju studije, svi materijali korišteni u studiji (kukci i sjemenska sačma) su uništeni.
Vrijeme objave: 29. srpnja 2024.